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本发明公开了用离子交换和反相色谱分离提取发酵液中脱落酸的方法,通过以下方式实现:首先利用大孔吸附树脂吸附发酵液中的脱落酸,对发酵液中的脱落酸进行初步的提取、浓缩;再用硅胶层析除去大量的发酵副产物,得到纯度较高(>90%)的天然脱落酸产品,将其经C↓[18]硅胶反相色谱分离提取之后,得到纯度达98%以上的天然脱落酸产品。该方法所用设备简单,成本低,得到的产品纯度高,解决了天然脱落酸在精制过程中天然脱落酸结构类似物难于除去这一难题,得到的高纯度天然脱落酸完全适合植物生理方面的研究。