[00138628]坏死增生性淋巴结病的免疫与Bc1-2Bc1-x Bax基因表达

任务来源：河北省科技攻关计划项目《坏死增生性淋巴病的免疫与Bcl-2、Bcl-x Bax基因表达》课题编号052761616。坏死增生性淋巴结病是近年才发现的疾病，是属于免疫器官受累的变态反应性疾病。发病原因不明，机理不清，该病来势凶猛，危害青少年健康。坏死增生性淋巴结病，属于一种炎性免疫性非肿瘤性淋巴结肿大疾病，淋巴结发生凝固坏死，长期发热，疗效欠佳，可能由于病毒感染后导致细胞免疫功能紊乱有关。该病免疫球蛋白升高，白细胞降低，说明B淋巴细胞系统亢进，同时T淋巴细胞免疫功能发生异常，CD4/CD8降低，CD8升高，CD8是Fax和Ptrin T细胞介导的诱导凋亡的效应器和靶细胞，而组织细胞是增强剂，由于该病免疫功能异常即有其他变态反应疾病的特点，抗原作用于T细胞抗原受体激活CD30＋T细胞和CD40配体表达。在T细胞的诱导下，B淋巴细胞多克隆活化和凋亡减少，产生大量免疫球蛋白和细胞因子，同时该病又启动了凋亡基因，过度表达使大量T淋巴细胞坏死凋亡。在光学显微镜下，可见淋巴结内大片凝固坏死，故属于少见炎症免疫反应，在此背景下，对该病各种凋亡的基因研究，Bcl-2、Bcl-x、Bax是多种细胞凋亡的调节基因，Bcl-2是抑制凋亡的基因，Bcl-x有两组，一种抑制凋亡，一种促进凋亡，研究这些调控基因及其表达，有助于探讨该病的免疫特殊性，探明该病的发病机理。应用技术领域或技术原理：该课题为应用基础理论研究，研究结果可指导临床对该病的治疗，技术原理：病人淋巴结活检，进行电镜、光镜检测，用Western Blotting检测基因蛋白的表达。材料：诊断为坏死增生性淋巴结病30例具有长期发热、淋巴结肿大疼痛、白细胞减少、免疫球蛋白增加、取淋巴结活检，对照组增生性淋巴结炎12例淋巴结活检，①病理切片②进行光镜、电镜检查③Western Blotting检测。方法：1、光镜检测：活检淋巴结，甲醛固定，石蜡包埋，切片染色。2、电镜检测：淋巴结组织用2,5-戊二醛固定，石蜡包埋，切片透射电镜检查（河北医科大学电镜中心检测）。3、Western Blotting检测Bcl-2、Bcl和Bax：冰冻淋巴组织，按10%（w/v）加入预冷的样品缓冲裂解液（0.32mol/L蔗糖、1mmol/L K-EDTA、10mmol/L Tris-HCl、pH7.4）5ml匀浆器磨碎组织后离心（4℃、1300g/5min），弃去沉渣，上清离心（4℃、7000g/15min）。取上清，按Bradford（2）的考马斯亮兰法测定样本蛋白质浓度，以BSA为标准。蛋白均50ug分别进行15%SDS-PAGE电泳分离，胶上的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上。用含10%脱脂奶粉和0.1%Tween-20的TBST溶液封闭1h，硝酸纤维膜先与抗Bcl-2和Bax抗体（Santa Cruz Biotechnology，CA）卵育，摇床缓慢振荡30min，4℃过夜。TBST洗膜3次，每次15min后，再与辣根过氧化酶标记的二抗（Gibco BRL）室温下摇床上卵育1h。TBST洗膜3次，每次15min，再用TBS洗膜1次，用增强型化学发光（Amersham Pharmacia Biotech，UK）检测系统检测。Western免疫杂交结果用Bio-Rad GS700型X光密度扫描仪定量分析，以Actin作为内对照，将目的条带光密度值与Actin光密度值作为目的蛋白相对表达量。性能指标：在规定时间内提前圆满完成了课题，该课题结果表明坏死增生性淋巴结病有免疫参与启动了凋亡基因。Bcl-2蛋白表达明显减少，与对照组比较（P＜0.05），Bcl-x变化不大，与对照组比较（P＞0.05），Bax/Bcl-2比值增加与对照组比较（P＜0.05）。该结果证实说明抑制凋亡基因表达下调，促凋亡基因过度表达，促凋亡基因与抑凋亡基因二者比例升高，故而使该病发生。大量淋巴器官淋巴细胞坏死凋亡，反应剧烈，持续时间长，一般治疗无效，用抑制免疫药物控制疾病的发展。共完成论文三篇。与国内外同类比较：国内无相同文献资料报道，与国内外同类研究相比较，该研究居国际先进，国内领先。国内一些文章均对该病症状描述，国外关于基因表达研究多为动物模型。而该项目取材于坏死增生性淋巴结病的淋巴结活检。成果创造性和先进性：该研究课题具有科学性、先进性、创新性，科研设计严谨，实验方法先进，实验结果真实，实验结论可信，属国内外领先水平。该课题研究组在查阅大量国内外文献的基础上对坏死增生性淋巴结病的机理予以阐明，具有明显理论研究的创新性和实践性。作用意义：意义就在于此项研究可在免疫疾病中发现其不同之处，具有发明新的变态反应疾病，基因调控特点，一般变态反应疾病均为凋亡缺陷，凋亡缺陷表现细胞凋亡受体及配体缺陷，凋亡产物清除不利以及凋亡信号紊乱。B淋巴细胞凋亡缺陷，产生大量免疫球蛋白，而该病同时启动凋亡因子促进因素，使凋亡基因过度表达，产生T淋巴细胞大量凋亡，找出凋亡基因活动关系，从而调整凋亡基因和各种介导因子关系，控制病情发展，使发病机理明确，进一步控制该病发生、发展及早日治愈。