[00138759]细胞外RNA和PKR-NLRP3炎性体系对小鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

①题来源与背景 尽管心肌保护方法在不断改进,缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）的心肌损伤仍无法完全避免。双链RNA依赖性蛋白激酶（Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR）通过识别病毒dsRNA 等小分子物质,在先天免疫防御中发挥重要作用。PKR 能介导炎性小体包括NOD样受体（NOD-like receptor, NLR）家族蛋白- NLRP1、NLRP3,促进白介素（Interleukin, IL）-1β、高迁移率族蛋白-1（High-mobility group box 1, HMGB-1）等炎症因子释放,调控炎症反应。有研究表明,抑制NLRP3、HMGB-1 的表达能减轻心肌I/R 损伤,缩小心肌梗死（Myocardial infarction, MI）面积。我们的前期研究表明,在I/R小鼠予注射核糖核酸酶（RNase1）预处理,心肌缺血区磷酸化PKR（p-PKR） 蛋白水平及IL-1β、HMGB-1等炎性因子表达下降,I/R损伤减轻;而PKR 基因敲除（PKRˉ/ˉ）小鼠的心肌缺血区IL-1β、HMGB-1等炎性因子亦减少,I/R损伤减轻。因此, 我们推测：心肌细胞损伤→释放到细胞外的RNA （extracellular RNA, exRNA）→激活PKR→介导NLRP3炎性小体→促进IL-1β、HMGB-1等炎症因子释放→参与心肌I/R损伤。 ②技术原理及性能指标: （1）技术原理：通过建立小鼠心肌I/R模型,对心肌I/R小鼠注射RNase1预处理,对比PKR、NLRP3及下游炎症因子、MI和缺血危险区（Area at risk, AAR）面积、心功能变化,并检测缺血区中性粒细胞浸润及细胞凋亡率;比较PKRˉ/ˉ及NLRP3炎性小体基因敲除小鼠心肌I/R后缺血区炎症反应情况、MI和AAR面积、心功能;观察分别抑制或过表达PKR、NLRP3的心肌细胞及相应基因敲除小鼠的骨髓来源巨噬细胞对坏死细胞介导的炎症反应。阐明exRNA和PKR-NLRP3炎性体系在心肌I/R损伤中的作用,为防治心肌I/R损伤提供新的干预靶点。 （2）性能指标：构建小鼠心肌I/R模型,评价各组小鼠的心功能,比较各组AAR及MI面积,检测各组缺血区PKR、NLRP3、ASC、Caspase-1及HMGB1,测定缺血区炎症因子表达情况,检测心肌组织中性粒细胞浸润情况,计算缺血区细胞凋亡率。 ③技术的创造性与先进性： 本技术具有较强创新性,研究成果处于国内外先进水平。通过对本技术的研究应用,首次提出了exRNA通过介导PKR-NLRP3炎性体系在急性心肌I/R 损伤中的作用;探讨exRNA、PKR在急性心肌I/R损伤的作用机制;通过整体动物及体外细胞实验,使用一系列新技术新方法,阐述心肌I/R损伤释放的exRNA,通过介导PKR,激活NLRP3炎性小体,促进IL-1β、HMGB-1等炎症因子释放,从而参与心肌I/R损伤,为临床防治心肌I/R拓展新视角,寻找新的干预靶点,具有较强的创新性及研究价值。 ④技术的成熟程度,适用范围和安全性; 本技术熟化度高,技术安全实用,适合应用于对心肌缺血再灌注损伤的防治。 ⑤应用情况及存在的问题： （1）应用情况：本研究能按进度计划和目标（预期发表1~3篇SCI学术论文）完成,提出exRNA通过介导PKR-NLRP3炎性体系在急性心肌I/R 损伤中的作用;探讨exRNA、PKR在急性心肌I/R损伤的作用机制;通过整体动物及体外细胞实验,使用一系列新技术新方法,阐述心肌I/R损伤释放的exRNA,通过介导PKR,激活NLRP3炎性小体,促进IL-1β、HMGB-1等炎症因子释放,从而参与心肌I/R损伤,为临床防治心肌I/R拓展新视角,寻找新的干预靶点。在该课题的基础上,项目负责人申请并获得了2019年度国家自然科学基金资助、广西自然科学基金面上项目各1项,发表SCI论文10篇,获授权专利2项 。 （2）存在问题：（1）实验动物数量不够多,尚需扩大样本量进一步验证;（2）本研究技术是在实验小鼠和细胞水平进行验证,有待进一步在灵长类动物甚至临床上进行验证。