[00138791]用于肾小管上皮细胞早期毒性检测的体外方法建立

近年来，有关中药毒性作用的报道频繁见诸于国内外研究刊物，其中中药肾脏毒性的报道最多，现已发现多种致肾脏急慢性损伤的中草药。肾小管损伤是中草药肾脏毒性最常见类型，其发病隐匿，毒性症状轻重表现与病理改变程度不一致，缺乏敏感的检测指标，难以早期诊断。以往中药肾脏毒性的评价多采用整体动物试验，但传统的动物实验周期长、耗费大、毒性检测指标不敏感，重复性差。因此，有必要建立一种快速、经济，能够在早期敏感地检测到中药肾小管毒性的方法。本课题中，将肾小管上皮细胞培养在微孔膜上，模拟体内细胞生理状态。通过观察药物作用细胞后某些物质经细胞转运的改变，实现对中药肾毒性的早期检测，并为进一步研究中药毒性机理奠定基础。 通过本研究，我们确定了建立MDCK细胞单层模型的最佳细胞接种密度为5×104/cm2，当检测细胞跨膜电阻（TEER）值达到200Ω·cm2以上时，细胞形成完整致密的细胞单层，这一生长时间大约是5-6天。此时，细胞两侧ALP分泌呈现极性，AP侧与BL侧ALP活性比＞3；150min内，细胞对荧光素钠的累积透过率＜5﹪；HE染色见细胞连接紧密呈片状，胞核及核仁清晰；扫描电镜下可见位于细胞顶端的树枝状细小微绒毛。试验结果显示，6mg/ml庆大霉素不会造成MDCK细胞单层对荧光素钠通透性以及细胞形态学观察的改变，但能使细胞LDH、ALP和GGT释放增加。说明这一浓度的庆大霉素不会引发细胞单层结构的损害，但是对细胞的功能会造成影响。6.25μg/mL和12.5μg/mL 的AA可以造成MDCK细胞单层完整性的破坏，且呈剂量依赖性，体现在细胞对荧光素钠通透性的增加和电镜下可见的微孔滤膜外露。除了大剂量组可引起LDH释放水平增加，AA不会造成明显的细胞酶释放异常，细胞两侧ALP和GGT的活性没有明显改变。由此可见6.25μg/mL和12.5μg/mL AA能够造成MDCK细胞单层结构的损伤，但不会显著影响细胞酶的释放水平，这一现象可能是由于细胞发生了凋亡。 本研究的结果提示，利用微孔滤膜建立起来的MDCK细胞单层相比传统体外药物肾毒性的研究方法，可以在对细胞没有显著性抑制的较低药物浓度，从更为全面的角度阐释药物对细胞毒性作用的发生。因为药物对细胞造成毒性损伤的机制不同，因而对检测指标的敏感性也有所不同。应将细胞单层的完整性检测、细胞形态学观察与酶活性测定多项结果相结合进行判定，进而实现药物肾小管上皮细胞毒性的早期检测。 本项目创新点为：国内尚未见使用微孔膜技术培养肾小管上皮细胞的报道，且无用该种细胞培养方法其应用于药物毒性检测的，同时目前尚未见体外检测中药对肾小管上皮细胞早期毒性作用的方法。 本研究历时3年，目前待发表文章2篇，并在本研究的基础上申请了2012年北京市自然基金的面上项目1项。基本按照任务书中的要求，完成了相应的研究。