[00138964]脐带间充质干细胞长期体外培养生物学及遗传稳定性研究

间充质干细胞是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞。MSCs最初在骨髓中发现,目前已在骨髓、脂肪、脐带、脐血、胎盘等组织和体液中分离到MSCs。因MSCs具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。但大部分实验和临床应用的MSC主要来源于成人骨髓,而骨髓来源的MSCs具有取材给供者造成痛苦,增加感染的危险,其增殖能力随着年龄增长存在下降趋势,短期内难以扩增出所需数量细胞,存在伦理问题等缺点。与成人骨髓相比,脐带具有来源广泛,采集容易,不受伦理限制和短期能够扩增出临床所需数量细胞等优越性。但目前从脐带分离的方法较复杂,分离用时较长,本项目采用单一酶消化法缩短了分离用时,分离成功率可达100%。 根据国际细胞疗法协会提供的标准,培养条件下的MSCs必须满足以下条件： ①细胞贴壁生长。 ②细胞免疫表型中CD105,CD73和CD90的阳性率必须大于95%,而CD45,CD34和HLA-DR的阳性率不高于2％。 ③具有分化成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力。但未对用于临床治疗的MSCs的培养时间、培养代数做出明确的规定。MSCs在体外培养的过程中,与培养器皿、分离液、血清、细胞因子等开放接触,连续培养可能使干细胞的生物学特性发生变化,因此长期体外培养MSCs的安全性仍然是个值得讨论的问题。 本项目经我院产科产妇同意后,无菌条件下收集剖宫产足月健康新生儿脐带,采用单一酶消化法分离脐带间充质干细胞。根据国际细胞疗法协会提供的标准对分离出的细胞进行鉴定,成功分离了脐带间充质干细胞,成功率达100%。再以脐带间充质干细胞为研究对象,在体外长期培养脐带间充质干细胞直到不能继续传代为止,可传至P28左右。我们对每代细胞的生物学特征,干细胞特性和染色体核型都进行了检测,发现随着细胞代数的增加细胞由梭形变得宽大扁平;细胞倍增时间延长（P3 vs P15,P＜0.05）;但流式细胞术检测其细胞免疫表型变化不大(（P3 vs P15,P＞0.05）;向脂肪细胞的诱导分化能力减弱,相关基因FABP4表达增加（P3 vs P15,P＜0.05）;向成骨细胞的诱导分化能力增强,相关基因ALP表达减少（P3 vs P15,P＜0.05）;衰老细胞增多,衰老相关基因P21表达增加（P3 vs P15,P＜0.05）;成纤维细胞集落数减少（P3 vs P15,P＜0.05）,直至不能形成集落;干性相关基因SOX-2,NANOG,OCT-4表达减少（P3 vs P15,P＜0.05）;但染色体核型分析仅见中期分裂相减少（P3 vs P15,P＜0.05）,并未见到异常核型。综合上述实验结果分析认为脐带间充质干细胞体外连续传代培养后,细胞形态发生改变,增殖速度明显下降,多向诱导分化能力发生变化,干细胞特性减弱,虽然核型未发生变化但分裂相明显减少,表明临床治疗时应选用代数较低的细胞,避免将增殖能力减弱,干性减低,衰老的细胞用于治疗,必要时可在治疗前进行生物学特性,干细胞特性和染色体核型分析检测,为临床治疗提供最佳代数、最高质量的脐带间充质干细胞,造福患者,具有潜在重大的经济和社会效益。 该项目为脐带间充质干细胞替代骨髓间充质干细胞用于临床治疗提供了技术支持和理论基础,如能先在动物体内对其安全性进一步加以讨论,并作出评价,再尝试纳入一定数量的患者,给予治疗,探索脐带间充质干细胞的临床疗效,则能更好的保证患者安全和指导临床应用。