[00139272]EB病毒相关肿瘤组织中肿瘤相关基因和病毒基因甲基化状态的检测与分析

EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV） 为DNA肿瘤病毒,具有淋巴细胞嗜性,与多种肿瘤的发生相关,其中与部分胃癌发生的关系已得到确认。EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma, EBVaGC）约占胃癌总数的7%左右,每年全球约有9万左右的胃癌患者为EBVaGC,因此对EBVaGC发生机制的研究具有重要意义。DNA甲基化可调节EBV基因组及病毒感染宿主细胞基因组的表达,深入探讨EBV调节宿主相关基因启动子活性的表观遗传学机制可进一步阐明EBV致癌机制,为EBV相关肿瘤的病因学研究以及寻找更具特异性的诊断和治疗方法提供理论依据。 EBV感染包括潜伏期感染和裂解期感染两种类型,在EBVaGC中EBV表现为Ⅰ型潜伏状态,但EBV公认的病毒癌基因LMP1不表达,且在EBVaGC中还可检测到EBV裂解期基因BARF1和BHRF1的表达。由于EBVaGC独特的基因表达特征,因此对其基因表达或沉默具体机制的研究具有重要意义。本研究选取EBV阳性及阴性胃癌细胞系和EBVaGC及EBV阴性胃癌（EBV-nagetive gastric carcinoma, EBVaGC）标本,检测EBV潜伏期基因（LMP1,LMP2A和LMP2B）、裂解期基因（BARF1和BHRF1）以及宿主细胞基因（WNT5A,Rb,TGF-β1,WIF1,NLK和APC）启动子区甲基化状态,系首次在EBV相关肿瘤中系统检测病毒基因及宿主基因启动子区甲基化状态,结果显示甲基化参与调控EBV自身及宿主基因表达,主要发现如下： 1.B95-8细胞系中LMP2A启动子为非甲基化状态,LMP1、LMP2A和LMP2B在其它细胞系中均呈部分甲基化状态。去甲基化药物作用后,可改变EBV阳性细胞系GT38和B95-8中病毒基因的甲基化状态,进而影响其表达。 2. LMPs启动子在所有EBVaGC组织中均呈高甲基化状态;甲基化能明显抑制LMP1在B95-8、Raji、GT38和AGS-EBV细胞系中的表达;LMP2A在GT38中的表达受甲基化调控,而在B95-8、Raji、GT39和AGS中甲基化并非是主要因素;LMP2B在Raji、GT38和AGS中LMP2B表达受甲基化调控。 3. EBV阳性细胞系和EBVaGCs组织中EBV裂解期基因BARF1 和BHRF1启动子呈甲基化状态,高甲基化可抑制BARF1 和BHRF1表达。 4. WNT5A编码基因启动子区高甲基化是EBV阳性细胞系WNT5A表达缺失或下调的重要机制;EBVaGC组织中WNT5A编码基因启动子区呈高甲基化状态,其甲基化状态明显高于EBVnGC。 5. 外源性WNT5A表达可诱导EBV阳性细胞系SNU719中某些细胞因子,如β-Catenin、JunB、ATF2、EGFR表达水平的变化。 6.胃癌组织细胞中Rb基因异常甲基化较为常见,EBV可诱导Rb基因甲基化,进而影响其表达参与EBVaGC的发生;而胃癌组织中EBV感染对TGF-β1编码基因的甲基化以及蛋白表达无明显影响。 7. Rb异常甲基化、表达缺失及TGF-β1表达检测可作为临床判断胃癌浸润和转移的重要参考指标。 8. LMP1可调控MMP9,Survivin和CDK4表达,LMP1与TGF-β1相互作用可调控ICAM-1和EGFR的表达。 9. Wnt通路抑制因子WIF1、NLK、APC在胃癌和鼻咽癌细胞系中均处于高甲基化状态;EBV编码miR-BART19-3p参与抑制3种基因的表达;EBV可通过甲基化及miRNA调控Wnt通路,使通路处于激活状态,参与宿主肿瘤的发生。 本研究对阐明EBVaGC中病毒如何通过自身基因高甲基化导致的表达沉默,进而逃逸宿主细胞免疫监视,并参与调控宿主基因表达提供了实验依据,对探讨EBV相关肿瘤的发生具有重要意义,为寻找EBV相关性肿瘤早期诊断、预后判断和治疗的新靶点提供实验基础。