[00139408]羊胚胎干细胞体外培养研究

一、项目来源与背景： 该项目为山西省农业科技攻关项目,编号：20050112。 胚胎干细胞的分离培养建系是现代生物技术研究的热点和焦点,具有非常重要的研究价值,而羊胚胎干细胞的分离培养体系的还十分不成熟。本课题组长期从事羊胚胎移植工作,在长期的实践工作中发现,由于供体羊冲胚数量不一致,加之受体羊同期发情不理想,这样就造成冲出的有效胚无受体羊可移,造成了胚胎的极大浪费。在这种情况下,项目组为了有效利用冲出的宝贵胚胎,在大规模羊胚胎移植的基础上,试图分离培养羊胚胎干细胞,做更深层次的研究和探索。 二、技术原理及性能指标： 采用先进的羊胚胎移植技术,同情发情→试情交配→采集胚胎→胚胎保存和移植,剩余胚胎进一步培养到孵化囊胚→孵化囊胚在饲养层细胞上的进一步培养→羊原代胚胎干细胞→羊胚胎干细胞的传代→从细胞形态学、核型分析和AKP染色鉴定羊胚胎干细胞→羊胚胎干细胞的心肌诱导分化→从细胞显微和超显微形态结构、免疫细胞化学和PAS染色鉴定分化细胞具有心肌细胞的特征。 项目组共进行了“羊胚胎采集与保存技术”、“羊胚胎干细胞分离培养与鉴定”、“羊胚胎干细胞的解冻与复苏技术”及“羊胚胎干细胞诱导分化技术”等12项研究。使羊胚胎的保存时间由4～6小时延长至10小时以上;建立了波尔山羊的ESC系并成功诱导分化出心肌细胞团。同时进行了3000余枚有效胚的移植推广,产成活羔羊1890只。 三、技术的创造性与先进性： 1、项目研制了新型羊胚胎保存液（PBS+2.0﹪五味子木脂素）,可使羊胚胎从桑葚胚到扩张胚发育时间由4～6小时延长至10小时以上,提高了有效胚的利用率。 2、成功分离、培养了羊胚胎干细胞,建立了波尔山羊的胚胎干细胞系,并传至第6代。 3、研究确定了10﹪5-氮胞苷为最佳诱导浓度,成功的将羊胚胎干细胞诱导分化出心肌细胞团。 四、技术的成熟度、适用范围和安全性： 本项目建立的山羊胚胎干细胞技术体系对于将来开展羊转基因克隆等高新技术提供了难得的平台,对于胚胎移植后多余的优良胚胎的充分利用提供了新的研究思路。 五、应用情况及存在的问题： 项目采用边试验边推广应用的方式,五年来项目共进行6批次230只（其中包括试验用80只）纯种（波尔山羊和道赛特、特克赛尔）供体羊胚胎采集工作,累计收获有效胚3335枚（平均14.5枚）,除300枚用于干细胞分离培养外,其余3035枚用于胚胎移植,先后在我省晋中榆次、寿阳、原平、大宁等市县的3000余只受体羊进行了胚胎移植示范推广,移植成功率平均为70.0﹪,产羔2100只,成活羔羊1890只（成活率90﹪）,每只优种羔羊按2500元计,共创经济效益472.5万元。存在问题在于,由于羊胚胎干细胞传代次数有限,没能够进一步进行羊胚胎干细胞诱导分化为其他组织细胞的方法学研究。