[00140129]一个新的小鼠石骨症相关基因CCDC154的遗传验证及功能研究

CCDC154是申请人率先发现的一个与小鼠石骨症相关的基因。在本课题中我们通过遗传学和细胞生物学实验证实了CCDC154是小鼠石骨症致病基因。我们对CCDC154的结构和生物学特性进行了分析,发现其在人和小鼠上具有高度保守性,含有Cyclin 结合域等多个功能域。细胞定位发现CCDC154 表达于初级内体。进一步地,我们发现CCDC154 具有抑制细胞生长的功能。MTT、细胞计数和平板克隆形成实验证实过表达CCDC154显著抑制 HEK293和Hela细胞生长。初步的机制研究表明过表达CCDC154下调 Cyclin B1-Cdc2复合体的表达,导致细胞于G2/M期停滞。另外,缺失突变体研究发现含有2个Cyclin结合域的片段具有与CCDC154全序列几乎完全一致的抑制细胞生长活性,缺失1个Cyclin结合域的片段的抑制活性低于全序列,而同时缺失2个Cyclin 结合域的片段不具抑制活性,提示Cyclin结合域在CCDC154抑制细胞生长中可能起关键作用。综上,我们发现 CCDC154 是导致ntl小鼠石骨症的致病基因,其致病机制可能与破骨细胞ruffle border形成、吸附能力等相关;CCDC154 是一个细胞生长调控因子,其上的 Cyclin 结合域可能在调控细胞生长中起关键作用。此部分研究结果均是原创性的,已经发表于Cell cycle, 11（17）: 3270-3279（2012）（影响因子 5.35）。此部分研究成果为深入探讨CCDC154 在石骨症和其它骨骼疾病中的作用奠定了理论基础,同时也为细胞生长、细胞周期调控的研究提供了新的靶点和途径。 在研究CCDC154的过程中,我们还发现了另外一个与之相关的调控细胞生长基因RSPO2。RSPO2是R-spondin家族中一个具有Wnt 信号激活功能的分泌蛋白。通过对肠癌细胞和临床样本的检测,我们发现RSPO2 在绝大多数肠癌细胞和肿瘤组织中表达均出现显著下调。RSPO2的表达下调是由于其启动子部分的高度甲基化造成的。进一步研究发现RSPO2可显著抑制肠癌细胞生长和增殖,起着抑癌基因的作用。RSPO2 对肠癌生长的抑制是通过对经典的Wnt 信号途径的抑制来实现的。RSPO2对经典 Wnt 信号途径的抑制作用依赖于LGR5基因的表达水平。RSPO2刺激可以迅速地加强Wnt靶基因LGR5的表达,RSPO2进而与LGR5相互作用从而稳定细胞膜上的ZNRF3,促进LRP6和磷酸化LRP6的降解,达到对Wnt信号的抑制。临床肠癌样本中RSPO2与LGR5的表达呈现负相关性。根据这些研究结果,我们提出了一种全新的Wnt信号通路调节分子机制,即RSPO2与LGR5相互作用,反馈性的抑制细胞内的Wnt/β-catenin信号途径,最终达到抑制肠癌形成和发展的结果。RSPO2基因之前被广泛认为是一个致癌基因。我们的研究首次证实RSPO2 在人类肠癌上起着抑癌基因的作用,并揭示了RSPO2是与LGR5相互作用形成Wnt 信号途径负反馈机制来抑制肠癌细胞生长。在这一原创性发现已经发表于Nature Communications,5:3149,doi:10.1038/ncomms4149（2014）（影响因子10.02）。同时我们已将RSPO2开发成为一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物,并申请获得了一项国家发明专利（专利号ZL 2012 1 0356301.9）。我们的研究成果为肠癌的研究和治疗提供了一个新的靶点,同时也为Wnt 信号通路的研究提供了新的方向,具有重要的科学意义。 在项目进行过程中,我们利用部分经费对PTEN基因对肠癌化疗的耐药性进行了研究。结果发现,与野生型相比,PTEN敲除细胞对CPT-11、5-FU、DHA的敏感性并无显著性差异,对姜黄素的敏感性明显增加。PTEN 缺失增加肠癌细胞对姜黄素的敏感性进一步为克隆形成实验结果所证实。最后,我们利用细胞凋亡实验对PTEN 缺失导致肠癌细胞对姜黄素敏感性增加的分子机制进行了初步探讨。我们研究结果将为姜黄素类化合物可作为新型抗结直肠癌的PTEN个性化治疗药物提供理论依据。相关结果发表在World Journal of Gastroenterology（影响因子2.58）。 本项目进展顺利,现已超额完成预定目标。本项目的主要研究成果被国家自然科学基金委遴选为突破性研究成果,并在Science Foundation in China上进行报导。每年仅有约60项国家自然科学基金项目获此殊荣。