[00141326]基于启动子报告基因技术的环境污染物毒性快速评价

1、课题来源与背景 近年来,城市大气污染对人类健康的影响受到社会各界的广泛关注。据世界卫生组织统计,我国每10万死者中即有161.1人死于空气污染。流行病学研究表明,人群暴露颗粒物等空气污染物不仅可增加呼吸和心血管系统疾病的发病风险和死亡率,而且与肺癌发病率和死亡率的增加密切相关。有效预防和控制环境相关疾病的前提是客观了解环境污染物对机体损害的早期表现,并能做到早期检测、早期预防。 目前污染物毒性监测与评价方法主要有化学分析和毒理实验。化学分析通过测定化学污染物的构成推断人体接触水平,评价其暴露风险。但复合型环境污染物成分复杂,化学分析无法全面反映污染物的成分和危害。传统的毒理实验虽然可以反映污染物的毒性,但往往耗时长、操作复杂,且常用的染毒剂量（≥ 0.1 mM）远高于人群在环境中的实际暴露量。因此,传统的污染物监测与评价方法可能不够灵敏,而将其结果用于预测污染物对人群健康的早期危害也不太客观。多项研究表明,基因水平的变化可作为化学污染物毒性的重要评价指标。基于基因工程原理发展起来的报告基因技术可将基因的转录水平通过报告基因反映出来,并因具备操作简便、灵敏度高的优点而成为分析基因转录与调控的便捷工具。 2、研究目的与意义 作为环境污染物对机体应激反应中发挥重要作用的蛋白,HSPA1A和GADD45α对各种环境应激因子都十分敏感,并逐渐成为环境污染物对细胞或生物体早期氧化和遗传损伤的重要标志物。因此,本项目构建基于报告基因技术构建了HSPA1A 和GADD45α启动子调控的萤光素酶报告基因细胞系统,将不同浓度的环境化学污染物、人工合成纳米材料和环境复合型污染物作用细胞系统,建立报告基因表达与细胞氧化和遗传损伤水平之间的联系,为不同类型环境污染物早期毒性的快速评价提供一种新的测试系统。 3、主要论点与论据 本项目研究结果表明： （1）不同环境污染物毒性差异较大,颗粒物所致细胞毒性与颗粒物大小、离子解离程度及表面所含多环芳烃的总浓度密切相关; （2）环境化学污染物（苯并（a）芘、甲醛、芘、亚硫酸氢钠）、人工合成纳米银颗粒和环境复合型污染物（焦炉逸散物相关PM2.5颗粒物的有机提取物）均可不同程度地诱导启动子细胞系统报告基因的表达（芘不能诱导GADD45α细胞系统报告基因的表达增加）,并具有明显的剂量-效应和时间-效应关系; （3）细胞萤光素酶活性与氧化和遗传损伤水平的变化基本一致,显著诱导细胞萤光素酶活性增加所需的最低剂量（ng/L）和最短处理时间（1 h）基本小于或等于诱导细胞氧化（丙二醛浓度、活性氧水平、GSH depletion）和遗传损伤水平（Olive尾距和微核率）显著增加所需的最低剂量和最短处理时间,启动子细胞系统的萤光素酶活性可作为环境污染物对细胞早期氧化和遗传损伤的敏感指标; （4）与传统的评价细胞氧化和遗传损伤的实验相比,HSPA1A和GADD45α启动子细胞系统操作简便、检测时间短、并可实现多样本批量（96 孔板）检测。 4、创见与创新 （1）成功利用两个富含代谢酶的体外培养细胞系构建了启动子报告基因系统。该系统可在无S9辅助作用下代谢多种化学毒物,实现污染物毒性的客观监测; （2）不同环境污染物诱导的细胞毒性差异较大,颗粒物所致细胞毒性与颗粒物大小、离子解离程度和表面所含多环芳烃总浓度密切相关。 （3）萤光素酶活性与细胞氧化和遗传损伤指标基本一致,可客观反映环境污染物对细胞的氧化和遗传损伤作用; （4）不同待测环境污染物作用后,启动子报告基因细胞系统的萤光素酶活性变化差异较大,可用于探索新型或未知的单一和复合环境污染物的细胞毒性,并初步判定其相对毒性强弱; （5）利用启动子报告基因细胞系统评价环境复合污染物的毒性,所用的染毒剂量与人群在环境中的实际暴露量较为接近,可为低浓度环境污染物毒性的速评价提供一种新的测试系统; （6）报告基因技术具有耗时短、操作简便、灵敏度高、可实现多样本批量（96 孔板）检测等特点,可从细胞分子水平的角度检测基因启动子活性（报告基因表达水平）的变化,从生物机制上反映环境污染物的早期作用。 5、社会经济效益 （1）本研究中我们使用环境化学污染物、人工合成纳米银颗粒、焦炉逸散物有机提取物等作用于启动子报告基因细胞系统,通过与细胞损伤指标之间的对比分析,建立报告基因表达与细胞毒性之间的联系,阐明了不同类型环境污染物的毒性作用差异,为环境污染物毒性的快速评价提供一种新的测试系统; （2）利用启动子细胞系统评价复合型环境污染物的毒性,是将成分复杂的化学污染物作为整体,探索其毒性作用,实验中涉及的染毒剂量与人群的实际暴露剂量也较为接近,弥补了以往毒理实验需较高染毒剂量的不足; （3）热休克反应和DNA损伤反应是非特异性的细胞应激反应,通过检测其关键基因启动子活性,对于成分复杂化学污染物的毒性评价具有重要意义,不仅能够反映污染物对机体的早期作用,而且可为环境相关疾病的早期预防提供一定的实验依据。