[00142160]4-HNE 抑制TNF-α 介导的NF-κ B 信号通路诱导酒精性肝病的发生机制研究

1.课题来源与背景：酒精性肝病（ALD）发病机制复杂,危害严重,且临床尚无有效治疗手段,已成为全球关注的公共卫生问题。研究认为,氧化应激是ALD发病过程中的关键环节,通过调控肝细胞信号转导通路,影响ALD的发生、发展。4-羟基壬烯酸（4-HNE）是肝长期暴露于酒精后诱发氧化应激而产生的一种致敏因子。我们前期研究表明4-HNE通过抑制肝细胞内TNF-α介导的NF-κB抗凋亡信路诱导ALD的发生,而且清除4-HNE可以逆转肝细胞死亡,但机制尚不清楚。因此本课题拟通过蛋白质互作技术和RNA沉默技术深入研究4-HNE抑制NF-κB信号通路的确切作用机制及靶点,拟从细胞信号调控及表观遗传学水平阐明4-HNE促TNF-α介导的肝细胞死亡的作用机理,并从体内和体外水平揭示ALD的发病机制。为ALD临床治疗提供新的策略,也为以4-HNE为靶点的治疗ALD的新型药物研发提供重要的理论指导和依据。 2.技术原理及技能指标： 技术原理：本课题拟应用C57BL/6小鼠ALD模型和3种肝细胞模型做如下研究：①从NF-kB、JNK、Caspase3等细胞信号调控角度深入研究4-HNE促TNF-介导的肝细胞死亡作用机理;②从IkBa的蛋白质修饰水平及其与4-HNE的生物分子互作水平探寻4-HNE调控NF-kB通路的作用靶点。结合ALT、AST、TG测定及HE染色等动物肝脏病理变化从体内和体外水平进一步揭示ALD的发病机制。 技能指标：⑴体内动物实验：和对照组相比,ALD模型组小鼠肝脏内甘油三酯、TNF水平升高（P＜0.01）,4-HNE蛋白质加合物表达增强,肝细胞脂质变性、凋亡数量增加,血浆中丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平升高（P＜0.01）;肝细胞核内NF-κB（p65）与DNA的结合活性下降,p65蛋白表达减弱,IκBα蛋白磷酸化表达减弱,4-HNE-IκB加合物表达增强。（2）体外细胞实验：①在HepG2及小鼠原代肝细胞中,与TNF组相比,4-HNE/TNF组肝细胞增殖活性下降,随着4-HNE、TNF浓度的增加,增殖活性呈剂量依赖性降低,细胞凋亡增多,细胞释放的乳酸脱氢酶活性升高（P＜0.05）,4-HNE/TNF组明显诱导PPAR蛋白剪切。②在HepG2细胞和小鼠原代肝细胞中,随着4-HNE浓度升高,细胞内4-HNE与蛋白质形成的加合物增多,与TNF组相比,4-HNE/TNF组肝细胞内4-HNE与IκBα形成的蛋白质加合物增多,IκBα的蛋白磷酸化水平降低。③随着4-HNE浓度升高,HepG2细胞核内NF-κB（p65）与DNA的结合活性下降,NF-κB调控基因（cFLIP、cIAP、Bcl-2）的mRNA表达水平下降。④4-HNE对TNF诱导的IKK无明显作用。⑤苯扎贝特通过清除4-HNE来减轻酒精性肝损伤。⑥NA能逆转 H2O2诱导的酒精性肝损伤,但对4-HNE诱导的酒精性肝损伤无明显作用。 3.技术的成熟程度、适用范围及安全性： 技术的成熟程度：⑴申请人自2005年工作以来一直长期从事肝脏疾病的分子机理及防治研究,并于2010年至2012年以博士后身份在美国伊利诺伊大学芝加哥分校人类营养实验室从事酒精性肝病的分子机理研究。本人曾发表多篇与肝病研究相关的SCI论文,在该领域具有很强的科研能力。申请者充分了解项目前沿动态,立题依据充分,对实验中可能出现的问题做了充分的估计并有相应解决措施,从理论和技术上为本课题顺利完成提供保证。⑵项目组成员均为专业教师或在读研究生,熟练掌握实验所需各项技术,且成员构成合理,涵盖了本课题所需的各学科人才,可以确保本项目的顺利实施。⑶申请者所在单位为国家中医药管理局“脂代谢研究三级实验室”和省高校“蛋白质组学重点实验室”,拥有试验所需的仪器设备及工作条件,已具备良好的实验动物学、分子生物学和细胞生物学技术平台,例如：动物造模、基因构建、RNA干扰、细胞转染、细胞凋亡、免疫共沉淀;也具有先进完善的仪器设备,例如：流式细胞仪、激光共聚焦扫描显微镜、扫描电镜、实时荧光定量PCR仪、HPLC分析仪等,可保证课题的顺利完成。⑷本项目是在查阅大量文献资料的基础上确定的,许多实验室的前期研究报道为实施本课题奠定良好的理论基础。本课题的相关研究是建立在我们前期研究结果之上,以及我们对4-HNE如何调节TNF-α介导的抗凋亡通路及其在ALD发生机制中作用的深入认识的基础上,确保研究目标的切实可行。 适用性：本课题的研究揭示了酒精性肝病的发病新机制,该成果可广泛应用于以4-HNE为靶点的治疗ALD的新型药物研发;也可为酒精性肝病的临床治疗提供新的策略。 4.应用情况及存在的问题：本课题属于基础研究,课题顺利完成并于2014年4月按照国家自然科学基金委员会的要求顺利结题（结题证明的编号：31000902-2143）。本课题组已利用该研究成果继续申报国家级及省部级纵向项目。