[00142367]以水通道蛋白5启动子为靶点治疗干燥综合征的中药筛选研究

1.课题来源与背景 课题来源：吉林省自然科学基金面上项目 背景：干燥综合征是一种侵犯涎腺、泪腺等外分泌腺为主的慢性自身免疫性疾病。随着人们生活方式的变化,其发病率越来越高,在成人发病率达0.5%-3.0%,好发于中老年女性,男女比例为1：9。严重地危害人们的健康,影响患者的生活质量。其临床表现为涎腺功能低下、唾液分泌减少进而引起口腔干燥,导致唇干、皲裂、猖獗龋、口腔黏膜溃疡、真菌和病毒感染并伴有灼痛,异物感等,影响义齿的就位和佩戴。病程长,临床诊断指标缺乏特异性,典型临床症状出现时间较晚,给疾病的早期诊断、治疗、预防各方面带来诸多困难。已成为一种严重危害人们的健康,影响患者生活质量的全球性疾病。水通道蛋白与腺体分泌密切相关。研究证明,AQP5是干燥综合征的关键基因靶点,是一种口腔干燥征的指示蛋白,在口腔干燥征患者唾液腺中表达量降低。本项目为确定天然中药缓解干燥综合征的关键靶点-水通道蛋白5之间的联系,选择以对水分子具有高度通透性并调控涎腺和唾液腺分泌的关键基因AQP5作为靶向,以启动子全长及截短型为靶点,建立以水通道蛋白5启动子为靶点的药物筛选模型,并进行中药筛选研究,最终筛选能够刺激目的基因表达上调的中药。 2.研究目的与意义 本项目为确定天然中药缓解干燥综合征的关键靶点-水通道蛋白5之间的联系,选择以对水分子具有高度通透性并调控涎腺和唾液腺分泌的关键基因AQP5作为靶向,以启动子全长及截短型为靶点,建立以水通道蛋白5启动子为靶点的药物筛选模型,并进行中药筛选研究,最终筛选能够刺激目的基因表达上调的中药,作用于特定靶点治疗干燥综合征。可指导临床应用此两种药物治疗干燥综合征,同时为干燥综合征的治疗策略开拓一条新的途径。 3.主要论点与论据 利用基因工程技术,通过NCBI数据库查找AQP5启动子序列,应用primer premier 5.0引物设计软件设计AQP5启动子的引物,以人类基因组为模板进行PCR,扩增得到目的片段。将扩增得到的目的片断与pGEM-T载体连接,经转化、提取等步骤得到重组质粒后, 酶切鉴定并测序。将克隆质粒和pGL-2载体进行双酶切后连接,经转化、培养和提取,构建pGL2-AQP5p重组质粒,酶切鉴定重组体,并且测序进一步确定。培养293T涎腺组织细胞,转染pGL2-AQP5p重组质粒,选择一定浓度的人参、西洋参、黄芪等7种代表中药刺激细胞。通过荧光素酶的表达,筛选对AQP5启动子基因片段有促进作用的药物。证明了一定浓度的人参和西洋参成分对AQP5启动子的表达有促进作用,可指导临床应用此两种药物治疗舍格伦综合征,同时为舍格伦综合征的治疗策略开拓一条新的途径。 4.创见与创新 目前国内外现代医学领域对干燥综合征尚无有效治疗药物。本项目选择以对水分子具有高度通透性并调控涎腺和唾液腺分泌的关键基因-水分子通道蛋白5作为靶向,以启动子全长及截短型为靶点,建立以水通道蛋白5启动子为靶点的药物筛选模型,并进行中药筛选研究,最终筛选得出西洋参和人参成分是通过上调涎腺分泌的关键基因AQP5来调控唾液分泌,增加唾液分泌,对舍格伦综合征的治疗提供了新型分子靶向和新思路。对于指导临床应用西洋参和人参治疗舍格伦综合征具有重要的理论意义和实际应用价值,研究成果先进。 5.社会经济效益 本项目为确定天然中药缓解干燥综合征的关键靶点-水通道蛋白5之间的联系,课题组克隆了AQP5启动子序列,成功构建了pGL2-AQP5启动子重组质粒,成功构建中药筛选模型,通过荧光素酶基因报告检测,最终筛选得出西洋参和人参成分是通过上调涎腺分泌的关键基因AQP5来调控唾液分泌,增加唾液分泌,对舍格伦综合征的治疗提供了新型分子靶向和新思路。对于指导临床应用西洋参和人参治疗舍格伦综合征具有重要的理论意义和实际应用价值,因干燥综合征患病率高,患者生活质量低,因此该成果可缓解干燥综合征的患者疾苦,因此具有很好的社会经济效益。