[00142436]几种果树种质资源超低温保存技术体系研究与应用

1、课题来源与背景 果树种质资源是发展果树生产和开展相关科研工作的基础。目前,番木瓜种质通常以种子保存,但种子实生后代性状易分离。香蕉、荔枝、柑橘和菠萝的种质保存主要通过建立资源圃的方法进行,该方法不仅占地广,管理成本高,而且容易受病虫害及自然灾害影响。因此,需要探索一种适合番木瓜、香蕉、柑橘、荔枝、菠萝种质资源长期稳定的保存方法。 课题来源主要有：广东省自然科学基金项目、广东省农业科学院院长基金以及单位自筹资金等。 2、技术原理及性能指标 1)技术原理 超低温保存是指在-80℃条件下保存种质的生物学方法（通常称为液氮保存）,在液氮温度下的组织和细胞,其生理代谢基本停止,材料变异的可能性最低,采用超低温保存技术进行果树种质资源保存,可以达到长期稳定保存的目的。 植物茎尖经过超低温保存后能成活的部位主要位于茎尖分生组织区,这些区域不带病毒或病毒含量低,由该分生区再生成的植株,可能成为脱毒材料。基于此,就可以将超低温保存技术应用于植物病原脱除。 2)性能指标 （1）首次建立了成年柑橘离体茎尖玻璃化法超低温保存技术：柑橘无菌芽上的茎尖,在MT+0.3 mol/L蔗糖+0.4 mol/L甘油上培养3 d;显微镜下剥取带2～3个叶原基的茎尖,室温下在MT+0.4 mol/L蔗糖+2.0 mol/L甘油装载50 min,在植物玻璃化溶液（PVS2）中处理60 min（0℃）后投入液氮中保存。从液氮中取出材料后放在40℃水浴中解冻,用MT+1.2 mol/L蔗糖洗涤2次,茎尖放在MT+6-BA 1.0 mg/L培养基上先暗培养一周后正常培养,可以实现植株再生。此外,柑橘超低温保存技术可有效脱除HLB、CTV和CEVd阳性材料中的病原,其脱除效率明显高于茎尖微芽嫁接脱毒效率。 （2）优化了香蕉离体培养条件,在国内首次建立了香蕉离体茎尖玻璃化法超低温保存技术。将离体培养的茎尖放在MS+0.4 mol/L蔗糖培养基上预培养2 d,显微镜下取带1～2个叶原基的茎尖（1.0～1.5 mm）,25℃下用装载液（MS+2 mol/L Gly+ 0.4 mol/L Suc）处理20～30 min,然后用PVS2（0℃）处理40 min,换一次PVS2后投入液氮中保存。从液氮中取出材料后放在40℃水浴中化冻,用1.2 mol/L蔗糖培养液洗涤,先暗培养10～15 h后再在MS+0.5 mg/L 6-BA的培养基上暗培养1周后正常培养。香蕉茎尖经过超低温保存后成活率为40.0%～75.9%、再生率为35.0%～63.4%。应用建立的超低温保存技术处理香蕉束顶病（BBTV）阳性材料,该技术对BBTV病原脱除率达60.6 %,明显高于常规茎尖脱毒率。 （3）优化了番木瓜离体茎尖培养体系,在国内外首次开展番木瓜茎尖玻璃化法超低温保存技术研究。无菌芽上的茎尖在MS+5% DMSO上预培养3d,显微镜下剥取含1～2个叶原基的茎尖,用先60%的 PVS2处理40～50 min,再在0℃条件下用PVS2处理30 min,换一次PVS2后投入液氮中保存24 h。从液氮中取出材料后在40℃水浴中化冻,然后用MS+1.2 mol/L的蔗糖液洗涤2次,经再培养后成活率和再生率分别为53.3%和51.6%。 （4）系统地研究了荔枝离体培养和体胚发生条件,首次建立了荔枝胚性悬浮细胞玻璃化法超低温保存技术。 （5）建立了高效的菠萝离体茎尖培养体系,在国内首次建立了菠萝茎尖玻璃化法超低温保存技术。 3、技术的创造性与先进性 根据查询国内外相关研究进展,并委托广东省科学技术情报研究所对本研究内容进行查新检索, 结果表明除本项目委托单位及合作单位外,未见其他单位有和以上查新点相同的研究报道。具体如下： 1)建立并优化了柑橘、香蕉、番木瓜等5种果树离体超低温保存技术体系。其中香蕉茎尖玻璃化保存后培养成活率达到40.0%～75.9%、再生率35.0%～63.4%;番木瓜成活率53.3%、再生率51.6%;菠萝成活率达到78.6%～96.5%、再生率达到76.7%～93.2%;荔枝悬浮细胞经超低温保存,相对成活率达到27.1%。 2)离体超低温保存技术体系实现了柑橘、香蕉等果树的脱毒功能。其中,柑橘黄龙病脱除率≥91.6％、衰退病脱毒率≥90.0％、裂皮病脱除率≥88.8％,明显高于茎尖微芽嫁接的脱毒率,并获得了14个柑橘无病原种;香蕉束顶病阳性材料,病原脱除率60.6 %,明显高于茎尖脱毒率。 4、技术的成熟程度、适用范围和安全性 取得的研究结果对果树种质资源保存、植物脱毒和无病苗繁育体系的建设均有借鉴作用,其应用范围主要是果树种质资源保存和病原脱除等。 5、应用情况及存在的问题 由于不同植物材料对低温敏感程度不一致,操作时需要针对每一种材料摸索其最佳保存条件;此外,利用超低温保存技术脱除植物病原时,并不是所有带病材料经过超低温保存后可以全部脱毒。 6、历年获奖情况 无