[00143899]CXCR7基因转染的内皮祖细胞促进糖尿病缺血性血管生成研究

一、 研究计划要点及执行情况概述 本项目的研究计划要点包括：1：构建高表达人CXCR7的工程化EPC细胞;2：体外模拟糖尿病环境,评价高表达人CXCR7的EPC成血管功能;3：利用db/db小鼠构建后肢缺血模型,体内评价高表达人CXCR7的EPC细胞促糖尿病缺血性血管生成的能力;4：探讨高表达CXCR7促进EPC糖尿病缺血性血管生成的分子机制。 目前,我们已经顺利完成了本项目全部4个研究要点。包括：1：利用高表达人CXCR7慢病毒转染EPC,成功构建高表达人CXCR7的工程化EPC细胞（Lv-CXCR7-EPC）,并通过Western Blot及流式细胞术检测证实;2：利用ox-LDL处理体外模拟糖尿病环境,发现Lv-CXCR7-EPC与转染空慢病毒的EPC（Lv-Null-CXCR7）细胞相比,具有更强的成血管能力以及存活能力,发现;3：利用db/db小鼠构建后肢缺血模型,体内证实糖尿病环境下Lv-CXCR7-EPC比Lv-Null-EPC有更强的促缺血性血管生成能力;4：证实CXCR7高表达能够增强EPC抗氧化能力,改善糖尿病诱导氧化应激。CXCR7高表达还能够增强EPC细胞的Akt活性,促进细胞存活。此外,Lv-CXCR7-EPC还具有比Lv-Null-EPC更强的分泌促血管生成因子VEGF,MMP-2等的能力。 本项目研究过程中的难点主要在动物实验部分。考虑到人脐带血来源EPC纯度高,项目最初设计利用人脐带血来源EPC做为种子细胞。即使使用了免疫抑制剂,向普通糖尿病小鼠输注人源EPC依然会导致严重的排异反应。使用裸鼠构建糖尿病模型成功率低,死亡率过高。最后采用鼠源EPC进行实验,解决了这一难题。 二、研究工作主要进展和所取得的成果 2.1 成功构建高表达人CXCR7的工程化EPC--Lv-CXCR7-EPC 本项目计划利用携带人CXCR7基因的腺病毒转染EPC构建高表达人CXCR7的工程化EPC。但考虑到腺病毒携带基因在细胞内表达时间较短（约1-2周）,且容易随细胞增殖而丢失。因此,本项目在实施的过程中改用高表达人CXCR7的慢病毒（Lv-CXCR7）转染EPC,以空慢病毒（Lv-null）转染的EPC为阴性对照。通过荧光显微镜观察（Fig.1A）,流式细胞术检测EPC胞内及胞膜CXCR7表达（Fig.1B）,以及通过Western Blot检测CXCR7表达（Fig.1C）,证实成功构建高表达人CXCR7的工程化EPC--Lv-CXCR7-EPC。 Fig.1. CXCR7慢病毒转染提高EPC细胞表面及胞内CXCR7表达水平。Lv-CXCR7及Lv-Null转染成功的EPC细胞表达绿色荧光蛋白（A）;流式细胞术（B）及Western Blot （C）检测Lv-Null-EPC及Lv-CXCR7-EPC细胞CXCR7的表达。 2.2体外证实糖尿病环境下Lv-CXCR7-EPC比Lv-Null-EPC有更强的促缺血性血管生成能力。 ox-LDL处理是被广泛认可的体外模拟糖尿病环境的方法。ox-LDL处理显著降低EPC细胞CXCR7的表达水平,但对CXCR4表达无显著影响（Fig.2）,提示CXCR7可能在EPC对抗ox-LDL引起的功能受损中起作用。ox-LDL处理会促进EPC凋亡,进而损害其血管形成能力（Fig.3）。在ox-LDL给药的情况下,无论是否添加外源性的SDF-1,Lv-CXCR7-EPC均表现出比Lv-GFP-EPC更强的血管形成能力（Fig.3A）及抗凋亡能力（Fig.3B）,证实糖尿病环境下Lv-CXCR7-EPC比Lv-Null-EPC有更强的促缺血性血管生成能力。 Fig.2. ox-LDL处理对EPC细胞CXCR4及CXCR7表达水平的影响。 Fig.3 ox-LDL处理情况下,比较Lv-CXCR7-EPC与Lv-Null-EPC血管生成能力和存活能力。通过基质胶成管实验考察血管生成能力（A）,并通过Annexin V- PI染色鉴定细胞凋亡（B）。 2.3 体内考察Lv-CXCR7-EPC促糖尿病缺血性血管生成的能力。 对db/db小鼠右腿进行股动脉结扎,建立糖尿病后肢缺血模型。确认造模成功后,通过尾静脉注射分别向小鼠输入PBS（阴性对照）、1x106个Lv-CXCR7-EPC或1x106个Lv-Null-EPC细胞。以未结扎的左腿为对照,激光多普勒检测考察输注Lv-CXCR7-EPC和Lv-Null-EPC对缺血后肢的血流恢复情况。结果显示：输注Lv-CXCR7-EPC一周后,糖尿病小鼠缺血后肢血流情况较PBS组有改善,而输注Lv-Null-EPC与PBS处理组无显著差异。细胞输注后2-4周,输注Lv-CXCR7-EPC与Lv-Null-EPC组小鼠后肢血流恢复效果要显著好于PBS处理组,且输注Lv-CXCR7-EPC组要好于输注Lv-Null-EPC组（Fig.4A）。证明输注Lv-CXCR7-EPC后,糖尿病小鼠缺血后肢血流恢复效果较输注等量的Lv-CXCR7-EPC要好。表明高表达CXCR7能够显著提高EPC细胞促糖尿病缺血性血管生成的能力。 细胞输注一个月后,截取缺血后肢腓肠肌进行组织学检测。通过慢病毒转让的EPC自带的绿色荧光示踪,结果显示Lv-CXCR7-EPC组小鼠有更多的EPC细胞掺入缺血部位（Fig.4B）,并在缺血部位形成了更多的毛细血管（CD31染色,Fig.4C）。这些结果进一步证实证明,Lv-CXCR7-EPC比Lv-Null-EPC具有更好的促糖尿病缺血性血管生成的能力。 Fig.4 CXCR7高表达EPC改善db/db小鼠后肢缺血。A)激光多普勒检测不同处理组db/db小鼠缺血后肢血流恢复情况;B)4周后,不同处理组小鼠缺血后肢腓肠肌含绿色荧光蛋白情况;C)4周后,不同处理组小鼠腓肠肌CD31染色检测新生毛细血管密度。 2.4 CXCR7通过改善EPC抗氧化能力改善其成血管能力 在体内、体外实验证实了Lv-CXCR7-EPC较Lv-Null-EPC具有更好的促糖尿病缺血性血管生成的能力之后,我们进一步探索高表达CXCR7改善EPC功能的内在机制。细胞内氧化应激压力是损害EPC功能的重要诱因。ox-LDL处理的EPC细胞内ROS含量升高,但Lv-CXCR7-EPC细胞ROS升高较Lv-Null-EPC小。接受SDF-1处理后,EPC细胞内的ROS下降,且Lv-CXCR7-EPC较Lv-Null-EPC更低（Fig.5）,提示高表达CXCR7通过改善ox-LDL诱导的EPC细胞氧化应激压力改善其糖尿病缺血性血管生成能力。 Fig.5 不同处理的Lv-CXCR7-EPC及Lv-Null-EPC细胞内ROS含量检测。 2.5 CXCR7增强Akt活性改善EPC凋亡。 Akt信号通路是调控细胞存活的重要信号通路。ox-LDL处理能够显著降低EPC细胞Akt的磷酸化水平,且外源性添加SDF-1对EPC中Akt磷酸化水平没有显著改善。ox-LDL处理同样能够降低Lv-CXCR7-EPC的Akt磷酸化水平,但外源性SDF-1能够提高其磷酸化水平（Fig.6）。 图6.不同处理组EPC细胞Akt磷酸化。 2.6 CXCR7促进EPC细胞分泌促血管生长因子VEGF及MMP-2 除直接参与血管生成之外,EPC还可以通过分泌促血管生长因子VEGF及MMP-2促进血管生成。明胶酶谱检测发现：无论是否有外源性SDF-1的存在,Lv-CXCR7-EPC细胞MMP-2分泌量均较Lv-GFP-EPC更高（Fig.7A）。Lv-CXCR7-EPC细胞VEGF分泌量虽然较Lv-GFP-EPC无显著差异,但在添加外源性SDF-1的情况下,Lv-CXCR7-EPC细胞VEGF分泌量显著高于Lv-GFP-EPC （Fig.7B）。这些结果表明高表达CXCR7还可以通过增强促血管生长因子VEGF及MMP-2的分泌来增强EPC的成血管能力。 Fig.7不同处理组细胞MMP-2及VEGF分泌能力。用明胶酶谱法（A）和ELISA（B）分别检测细胞上清中MMP-2及VEGF的含量。 三、本项目研究人员的合作与分工 本项目主要研究人员包括晏小清、戴小珍、程鹏、何露清、卢学勉、张翼、潘晓军等人。其中课题负责人晏小清主要负责课题设计、数据分析以及部分细胞实验;戴小珍博士主要负责动物实验,包括动物建模及缺血后肢血流恢复情况评价;硕士生程鹏、何露清主要参与Western Blot及免疫荧光染色部分;卢学勉负责早期实验中新生儿脐带血的获取;张翼主要负责内皮祖细胞分离培养鉴;潘晓军主要负责慢病毒转染EPC;硕士生张芳芳、林秀飞负责生化指标检测。 项目组成员唐云安由于离职退出本研究,硕士生贾丽丽、俞佳文、王燕由于毕业退出本研究。 四、国内外学术合作交流与人才培养情况 4.1组织国内外学术活动的情况,包括会议主题、内容、规模、时间、地点、效果等。 与温州市瑞安市人民医院（温州医科大学第三附属医院）共同组织第六届中美糖尿病并发症高峰论坛,会议于2015年11月7日在瑞安市辰茂阳光酒店举办,共计有来自国内外近400名专家和学者出席了本次会议。会议邀请包括李红、陈丰源、李忌、李于等多位国内外知名糖尿病及心血管疾病领域专家参加并作大会发言。会议交流了包括临床糖尿病治疗药物的选择及糖尿病及心血管疾病领域科研中的经验。 4.2研究生培养情况,列出研究生姓名、研究方向、论文题目、导师姓名、已答辩或预计答辩的时间。 程鹏、糖尿病及其并发症、FGF21对Angiotensin II诱导EPC损伤的保护作用、李校堃、预计2016年6月1日硕士答辩; 何露清、糖尿病及其并发症、CXCR7改善EPC成血管能力的机制研究、李校堃、预计2017年6月1日硕士答辩。 五、存在的问题、建议及其他需要说明的情况 本项目基本完成预期的研究目标,通过体内和体外实验证实提高CXCR7表达水平能够增强EPC促糖尿病缺血性血管生成能力,并证实SDF-1/CXCR7可以缓解糖尿病环境下EPC细胞氧化应激压力,增强Akt磷酸化水平改善其在糖尿病情况下促缺血性血管生成能力。此外,CXCR7高表达还能促进EPC分泌促血管生长因子MMP-2和VEGF。 存在的问题：1)高表达CXCR7增强EPC抗氧化能力,促进EPC分泌促血管生长因子MMP-2和VEGF的机制尚有待进一步阐明;2)慢病毒转染EPC存在安全性问题。 建议：1)考察CXCR7高表达对抗氧化相关蛋白如SOD, MT等表达的影响;2)筛选能够提高EPC细胞CXCR7表达的药物,避免使用病毒转染以改善CXCR7高表达EPC的安全性,并开展临床实验,力争将这一研究成果应用于临床治疗糖尿病病足等疾病。