[00144162]分子生物学技术在辣椒病毒病病原种类检测中的应用

1.课题来源与背景 （1）课题来源：“分子生物学技术在辣椒病毒病病原种类检测中的应用”是甘肃省农业农村厅农业生物技术研究与应用开发项目,项目编号：GNSW-2015-21,起止年限：2015～2018年。 （2）立项背景：辣椒是甘肃省的重要蔬菜作物,近年来辣椒病毒病危害日趋严重,但有关辣椒病毒病的研究较少,仅报道CMV和TMV侵染辣椒,是否存在其它病毒种类尚不明确。分子生物学检测法从核酸水平检测病毒,能克服血清学检测方法中的缺点。本项目通过分子生物学检测法对在全省辣椒主产区种植基地采集的辣椒病毒病发病疑似样本进行检测,明确我省辣椒病毒病病原种类和优势种群;进而对病毒优势种群,建立简单、快捷和有效的多重PCR体系。项目研究结果为我省辣椒病毒病病原准确快速检测、病毒病的有效防控及培育辣椒抗病毒病品种提供参考依据。 2.技术原理与性能指标 （1）技术原理：分子生物学检测法从核酸水平检测病毒,因而灵敏度高、特异性强,能克服血清学检测方法中的缺点,但单重RT-PCR,在1个反应管中只能检测1种病毒。如要检测复合感染样品中的几种病毒,则需进行数次RT-PCR反应,不仅操作步骤繁琐、易造成交叉污染,而且成本高、耗时长,不能满足现代生产的需求。辣椒植株能够同时被多个病毒侵染,为了提高病毒的检测效率,根据不同病毒间的同源保守序列,设计简并性引物,应用多重PCR检测方法,即在同一反应体系中加入多种待检病毒的特异性引物,使一次实验能够同时检测多种病毒,从而降低检测工作量及成本。但由于多重PCR实验设计较单一PCR要复杂得多,技术难度大,因而在建立多重PCR反应体系时,必须对其中的主要成分和反应条件进行优化。 （2）性能指标：①在全省辣椒主产区共检测出了7种辣椒病毒,分别为CMV,TMV,PMMoV,PVY,PVS,ToMV,TSWV,其中TMV在兰州检出率为66.7%,在张掖检出率为45.8%,TMV是兰州、张掖等地的优势病毒种群。②建立了ToMMV和ToMV两种辣椒病毒病病原优势种群二重RT-PCR检测体系。③提出了病毒病的简易防治方法。 3.技术的创新性与先进性 （1）利用双抗体夹心酶联免疫吸附法较为系统地检测了甘肃省辣椒主产区的病毒病病原种类,为辣椒病毒病的预防提供了技术支撑。 （2）在甘肃省首次通过RT-PCR方法检测出了辣椒ToMMV病毒,开发出检测ToMMV特异引物ToMMVcp：ToMMV-F: AAGAGTGGATGACGCAGGTC;ToMMV-R:GCGCGTTCCAAGACAAAACC。 4.技术的成熟程度、适用范围和安全性：建立的ToMMV和ToMV两种辣椒病毒病病原优势种群二重RT-PCR检测体系,能同时检测出ToMMV和TOM的感染,具有简便、快捷、高效、灵敏的特点,可以缩短检测时间,对辣椒种植区这两种病害进行快速评价。针对项目取得的主要结果,本项目提出了防控辣椒病毒病的措施包括防治病毒病较为有效的混配剂（阿泰灵＋克毒宝）。 5.应用情况及存在的问题：（1）应用情况：利用ToMMV和ToMV两种辣椒病毒病二重RT-PCR检测体系和防控辣椒病毒病的措施,对我省辣椒病毒病的鉴定、预防和治疗提供了一定的技术支撑。 （2）存在的问题：由于受对全省辣椒主产区采集样品数的限制,用酶联免疫吸附法仅检测出了7种辣椒病毒,其它在全国范围内报道的病毒未能检测出。前人报道,兰州地区辣椒CMV侵染普遍,是该地区的病毒优势种群,但本项目中,采用酶联免疫吸附法和RT-PCR方法均未能在病样上检测出该病毒。项目实施中调查发现,我省辣椒病毒病发生严重,在辣椒育苗期、成株期均普遍侵染。我省辣椒主栽品种陇椒2号、陇椒3号由于多年种植,对病毒病抗性下降,建议生产中应积极推广更新换代的辣椒品种。 6.历年获奖情况：无。