[00145851]食品小分子污染物的核酸适体筛选研究

近年来,小分子污染物的食品安全问题十分突出,发生了诸如三聚氰胺、苏丹红I、孔雀石绿、多种农药及抗生素等一系列严重的食品安全事件。控制小分子污染物对食品安全的潜在危害已势在必行。分析检测技术和分离净化技术是实现小分子污染物有效控制的必要手段。现有分析检测及分离净化技术中,抗体、受体、酶等特异性识别结合体发挥了重要作用。但是,这些特异性识别结合体在小分子化合物的检测分离中,均暴露出一定的自身缺陷。例如,由于小分子化合物不能直接刺激机体产生特异性的识别抗体,因此在多克隆抗体和单克隆抗体的制备过程中,常需通过小分子化合物自带的或改造后添加的活性化学基团,与载体蛋白偶联构建成人工抗原,再免疫动物获得相应的抗体或应答脾细胞。虽然噬菌体展示抗体制备技术无需免疫动物,但需将小分子化合物固相化以便构建抗体筛选的分离体系。因此,在小分子化合物抗体的制备中,小分子化合物的改造、载体偶联或固相化通常在所难免,这严重限制抗体在小分子化合物检测分离中的应用。受体和酶的主要缺陷是,仅对某一种或某一类小分子化合物具有特异性识别结合能力,应用范围有限。另外,抗体、受体、酶均是蛋白质类的特异性识别结合体,分子稳定性不佳,易受环境因素影响发生降解或活力改变。 1990年,Ellington 等人和Tuerk等人分别在Nature和Science上发表了关于体外筛选特异性结合某一靶分子的核酸分子的文章,并称这种核酸分子为“适体”。与抗体等蛋白质类特异性识别结合体相比,核酸适体具有多方面的应用优势： ① 适体为序列明确的寡核苷酸分子,相对分子质量小,通过化学合成很容易获得高纯度的适体; ② 对靶分子具有严格的识别能力和紧密的结合能力,这种能力通常高于抗体对抗原的识别及结合能力; ③识别的靶范围非常广,涵盖了细胞、细菌及病毒等完整生命体,生长因子、酶、抗体及多糖等生物大分子,肽、氨基酸、维生素、核苷及药物等小分子物质,以及钾、镍、钴等多种金属离子; ④ 分子修饰和标记比较容易,如磷酸化修饰、巯基化修饰、生物素标记、荧光标记以及酶标记等等,因此适体可与多种分析方法相结合; ⑤ 稳定性好,可长期保存。核酸适体是通过指数富集配体系统进化（SELEX）方法,从人工合成的随机寡核苷酸库中筛选获得。目前,人们已经发展出多种SELEX方法以提高适体的筛选效率,如自动化SELEX、毛细管电泳SELEX以及微流控SELEX等。这些新型的适体筛选方法针对的靶分子多是大分子物质,而针对小分子化合物的适体筛选方法一直没有突破性的发展。 基于上述有关小分子化合物核酸适体筛选方法的发展现状及问题,本课题组首先通过对三聚氰胺分子进行末端羧基化修饰,并将改造后的分子固相修饰于磁珠表面,依托磁珠分离体系,从人工合成的随机寡核苷酸库中筛选出能够特异性结合三聚氰胺的核酸适体,进而建立了针对三聚氰胺核酸适体的磁珠-SELEX筛选方法;同时,采用小分子非固相化策略,利用核酸探针将核酸库展示于磁珠表面,通过游离的食品小分子污染物将能与其结合的核酸分子从磁珠表面释放至液相,从而建立了针对三聚氰胺和甲胺磷的非固相化-SELEX筛选方法。上述针对食品小分子污染物所建立的核酸适体筛选方法,在国内外相关研究中尚属首次,在小分子化合物的配体理论研究中具有重要意义,更为食品小分子污染物检测提供了新的思路和工具。