[00146946]新型高效高灵敏度蛋白质荧光标记试剂盒的研制及应用研究

本课题选择荧光素作为荧光团,以N-羟基琥珀酰亚胺活性酯为反应基团,设计、合成新型的蛋白质荧光标记探针——6-氧-（N-琥珀酰亚胺顺丁烯二酸单酯）-9-（2’-甲氧羰基）荧光素（SSMF）。对合成的衍生试剂进行了结构表征、荧光性质研究,结果表明,合成的化合物与设计的目标化合物结构一致。进而利用新合成的荧光衍生试剂展开了在蛋白质检测领域中应用的研究,在此基础上,研制成基于该新型试剂的试剂盒。主要有以下工作： 1、以 6-氧-（N-琥珀酰亚胺顺丁烯二酸单酯）-9-（2’-甲氧羰基）荧光素为柱前衍生试剂,甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、乙醇胺为分离检测对象,建立了高效液相色谱分离荧光检测短链脂肪胺的分析方法。结果表明：SSMF 与甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、乙醇胺在pH8.0 H3BO3-Na2BO4缓冲溶液中,20℃的室温下衍生6 min,衍生反应即可充分完成;流动相为57+43（甲醇+10 mmol·l-1 H3Cit3-NaOH 缓冲溶液,pH 5.0）,检测波长分别为激发波长484nm 和发射波长516nm,6 种短链脂肪胺的SSMF 衍生产物可以达到有效分离,方法的线性范围为0.004-8 μmol l-1,检测限最低达到2 fmol。建立的分析方法成功用于测定红酒、白酒及奶酪中的短链脂肪胺,实验结果显示：样品中的氨基酸等化合物对短链脂肪胺的检测不会产生干扰,乙醇胺在所有的样品中,除奶酪之外,均可以被检测到;另外检测到了一定量的甲胺、乙胺、丙胺、丁胺;而在所有样品中均没有检测到戊胺和己胺。 2、选择氨基酸神经递质为分离检测对象,通过对SSMF 与氨基酸衍生条件和CE 分离条件的系统考察和优化,建立了高灵敏、高选择性的毛细管电泳分离/激光诱导荧光检测复杂生物体系中氨基酸神经递质的新的分析方法。最佳衍生条件是：在pH8.5的H3BO3-Na2B4O7缓冲溶液中,于30°C 下衍生25 min。以含100mmol/LSDS,8% v/v 甲醇,pH 9.6 的100 mmol/L 硼酸缓冲溶液为背景电解质,六种氨基酸神经递质的衍生产物在25 min 完全分离,线性范围在0.01～2 .mol/L 之间,检测限可达0.05 nmol/L（S/N=3）。将该方法应用于脑脊液和唾液中氨基酸神经递质的测定,回收率在94.0%～106.0%之间,RSD 在1.96%～5.15%之间。 3、选择牛血清白蛋白 （BSA）作为模型蛋白,以SSMF 标记BSA,激光诱导荧光检测,通过优化标记和分离条件及免疫反应条件,建立了毛细管电泳竞争免疫分析检测BSA 的新方法。最佳的标记条件：1.5×10-3 mol/L SSMF,室温与BSA 反应40 min;最佳的分离条件：28 kV 的分离电压,pH 9.3 100 mmol/L 硼酸溶液的背景电解质;最佳的免疫反应条件：室温下反应10 min。在最优化的条件下,BSA 的线性范围为5～200 μg/mL,检测限为0.1 μg/mL,方法的灵敏度比文献报道的采用荧光素异硫氰酸酯标记高30 倍。 在上述基础上,研制成功了基于6-氧-（N-琥珀酰亚胺顺丁烯二酸单酯）-9-（2’-甲氧羰基）荧光素的蛋白质荧光标记试剂盒,该试剂盒经验证,能够在至少10 个月内反应活性不降低,应光量子产率不降低的优势。