[00148264]丙型肝炎病毒大规模培养方法的建立及筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法

丙型肝炎病毒（HCV）是引起输血后病毒性非甲非乙肝炎的主要病原，主要通过血液及其制品的使用途径传播，也可通过密切接触和母婴传播。目前全球大约有1.7亿HCV感染者，尚无理想的治疗药物和疫苗，主要原因在于目前HCV还不能通过体外培养的方法大量获得，其主要来源是从感染者的血清中分离，使得实验材料的获得非常困难。针对这一现状，本项研究利用痘苗病毒复制系统建立了一套能大规模生产高滴度HCV的细胞培养系统，该系统包括一株插入T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒和两个质粒，其中一个质粒是在上游T7启动子和T7终止子之间插入了HCV基因组cDNA，可通过T7RNA聚合酶指导转录产生9.5kb的HCVRNA；另一质粒包含痘苗晚期启动子和编码HVC大前体蛋白的开放阅读框，可合成包装HCV的全套蛋白。将两个质粒共转染至被重组痘苗病毒感染的宿主细胞，在感染细胞中，T7RNA聚合酶合成后，依次转录含HCV基因组的质粒DNA，痘苗RNA聚合酶将转录编码HCV大前体蛋白的DNA，大前体蛋白被裂解后，病毒蛋白将包装HCV基因组RNA产生完整的病毒颗粒。该系统的特点是利用了痘苗病毒能完全在细胞质中利用自己的酶复制DNA和合成5′帽子及3′聚腺苷酸化的mRNA结构，即HCV基因组RNA被重组痘苗病毒的T7RNA聚合酶合成，编码病毒蛋白的mRNA被痘苗病毒相关酶合成，因此RNA合成不受HCV酶所限制，从而可大大增加DNA的拷贝数。目前国外报道最高的生产量也只能达106拷贝数/ml，我们的系统比国外最先进的系统产量至少高1个数量级。本项研究可为国内外的HCV研究者提供研究材料，为HCV减毒活疫苗的开发和生产奠定基础。另外，还可以生产含报告基因的重组HCV运用于药物的筛选、疫苗的筛选，以及支持HCV感染的新细胞或细胞系的筛选。更重要的是，本系统作为一个技术平台，还可以应用于其它难以培养的RNA病毒(如流感、AIDS)的生产及疫苗的研制，其产生的经济效益是不可估量的。综合上述情况，本研究是一项全新的技术，在学术上具有重要价值，同时具有极大的市场开发前景。本项目已申请发明专利一项：筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法申请号：03140431.6公开号：CN1594593A公开日：2005.03.16。项目成果合作方式：1.技术转让；2.合作开发。