[00148616]柑桔黄龙病早期分子诊断技术合作研究

1.课题来源与背景：本项目为广西壮族自治区科学技术厅2014年下达的广西科学研究与技术开发计划项目“柑橘黄龙病早期分子诊断技术合作研究”,下达文号：桂科计字〔2014〕123号文件,合同编号：桂科合14123001-15,由广西特色作物研究院承担,项目实施期限为2014年01月至2016年12月。 2.技术原理及性能指标：柑橘黄龙病菌在柑橘花器的雄蕊组织中相对分布均匀,取雄蕊组织并用高灵敏性分子检测技术,可准确诊断处于黄龙病发病早期的病树。本项目开发了一种高灵敏性的基于串联重复序列的柑橘黄龙病菌链式置换反应检测技术,该检测技术可以在任何常规PCR仪上操作,检测灵敏度达到10拷贝/μL。基于该检测技术和雄蕊组织的柑橘黄龙病早期分子诊断技术,在测试的样品中,诊断准确率达到95%以上。此外,本项目还完成了柑橘黄龙病菌非洲种全基因组序列,并明确了黄龙病通过种子传播缺乏证据。 3.技术的创造性与先进性： ①本项目建立的基于串联重复序列的链式置换反应检测技术,是一种全新的DNA扩增技术,可广泛应用于病原微生物的高灵敏性检测,而且实施门槛低,可在任何常规PCR仪上操作进行。基于该技术建立的黄龙病菌检测方法,灵敏度达10拷贝/μL,比常规PCR高100倍,比SYBR Green I实时荧光定量PCR高10倍。 ②对黄龙病树花器和种子不同组织中的黄龙病菌分布进行了研究,发现柑橘花器的花瓣、雄蕊、雌蕊及花粉等组织和柑橘种子的种皮及胚乳组织均可感染黄龙病菌。 ③通过和美国农业部农业研究服务署（USDA-ARS）合作,完成并公布了柑橘黄龙病菌非洲种全基因组序列（基因库登录号CP004021）,该研究成果有助于我们深入了解韧皮部杆菌属细菌的基因组进化,并可被用于与其它韧皮部杆菌属细菌基因组的比较分析,同时也有助于解析该细菌的致病机制。 ④本项目建立的基于雄蕊组织的柑橘黄龙病早期分子诊断方法,不依懒于症状识别,可在一定程度上有效弥补当前柑橘黄龙病分子诊断上的缺陷。 ⑤明确了带菌种子传播柑橘黄龙病缺乏证据,这为在非疫区和黄龙病低度流行区是否可使用来自黄龙病爆发区的柑橘种子提供了答案。 4.技术的成熟程度,适用范围和安全性：本项目建立的基于串联重复序列的链式置换反应检测技术,是一种全新的DNA扩增技术,可广泛应用于病原微生物的高灵敏性检测,而且实施门槛低,可在任何常规PCR仪上操作进行。本技术不存在安全隐患问题。 5.应用情况及存在的问题：本项目建立的基于串联重复序列的柑橘黄龙病菌链式置换反应检测技术,已于2016年5月起大规模应用于我区柑橘苗木样品及田间柑橘树样品的黄龙病菌检测工作。基于雄蕊组织的柑橘黄龙病早期分子诊断方法目前继续在测试中,但柑橘开花一般1年1次,而且花期时间不长,因此该技术未能多次大规模测试,需要在后期继续进行测试。 6.历年获奖情况本研究成果尚未申报奖项。