[00148663]基于宏基因组学技术的新酶基因功能研究

1、课题来源与背景 课题研究自2001年1月开始未培养微生物资源的利用研究,得到了包括国家科技部在内的多个项目资助。分别列举如下：（1）国家科技部863计划：未培养微生物基因资源的利用（2001AA214141）;该项目广西大学为合作单位。（2）2010年度国家自然科学基金项目：新型延胡索酸酶基因的异源高效表达和突变研究（31060016）。2010年度国家教育部博士点基金项目：利用酶法体外随机-定位诱变技术对新型延胡索酸水合酶基因的突变研究（20104501120002）。2012年度国家自然科学基金项目：生物合成牛磺酸的新型半胱亚磺酸脱羧酶的鉴定和特性研究（21262003）等。 2、研究目的与意义 酶制剂作为生物大分子活性物质,常出现稳定性脆弱或酶活易丧失等异常情况,特别是在极端条件下更易失活,因而限制了酶制剂在实际应用中的推广。如何寻找可以抵抗各种严酷条件的新酶蛋白,成为科学家们迫切需要解决的关键科学问题。 3、主要论点与论据 基于上述科学问题的考量,该项目主要利用宏基因组学技术,系统研究了亚热带特殊生态环境系统中的未培养微生物,构建了高容量的宏基因组文库。为解决实际微生物应用生产L-苹果酸工艺中延胡索酸酶活性不高、副产物多、且容易受天门冬氨酸转氨酶干扰等瓶颈问题,该项目从构建的环境宏基因组文库中分离筛选到了新的编码延胡索酸酶的新基因fumF。为解决目前工业体系中常温条件下利用纤维素发酵生产酒精时β-葡萄糖苷酶活性低下的问题,该项目分离筛选了一批新的β-葡萄糖苷酶。为开发高活性、小分子质量的新型丝氨酸蛋白酶抑制剂,该项目从构建的环境宏基因组文库中分离到了新的丝氨酸蛋白酶抑制剂Spi1C。为研究新的氨基酸脱羧酶和氧化酶的功能和作用机制关系,为相应的抗细菌药物筛选提供了新的靶酶,该项目分离筛选到了新的氨基酸脱羧酶Undec1A和氨基酸氧化酶DaoE等。 4、创见与创新 （1）在微生物学领域率先完整的鉴定了编码延胡索酸水合酶的新基因fumF。证实了FumF蛋白可以催化延胡索酸水合生成L-柠檬酸。该成果为构建新的微生物发酵工艺消除生产L-柠檬酸过程中天门冬氨酸转氨酶的干扰以及提高相关酶的活性等技术瓶颈问题提供了新的解决思路。 （2）系统完整的鉴定了4个编码β-葡萄糖苷酶新基因。发现新的Bgl1C蛋白和已知的β-葡萄糖苷酶没有任何一致性。发现Bgl1D蛋白既具有β-葡萄糖苷酶活性,也具有脂肪酶活性。发现Bgl1E蛋白是一个新的耐受高浓度金属离子的嗜冷β-葡萄糖苷酶。该系列成果为构建降解纤维素产乙醇的微生物工艺提供了新的材料。 （3）率先系统完整的鉴定了编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的新基因 spi1C。发现Spi1C蛋白对胰蛋白酶和α-糜蛋白酶具有较好的抑制功能。该成果提升了对丝氨酸蛋白酶抑制剂作用机制的认识。 （4）率先系统完整的鉴定了编码氨基酸脱羧酶的新的功能基因undec1A。发现Undec1A为HFCD超级家族蛋白的新成员。该研究成果为后续抗细菌药物筛选提供了一种新的靶酶。 （5）率先系统完整的鉴定了编码氨基酸氧化酶的新基因daoE。该成果增强了人们对氨基酸氧化酶作用机制的认识。 5、社会经济效益,存在的问题 该完成项目属于生物学领域范围内的应用基础研究。宏基因组学技术发展至今,还存在着不少”瓶颈”问题。诸如现在流行的各种环境样品宏基因DNA的提取方式对提取的DNA的纯度、片段长度及其代表性的要求还有待提高;另外,宏基因组文库的高通量筛选,尤其是功能驱动的筛选检出率不高,要做到高通量高效率的筛选仍然是十分棘手的问题。 6、历年获奖情况 （1）2011年度广西自然科学优秀论文二等奖：未培养微生物新型β-葡萄糖苷酶的鉴定和生化性质研究（Ⅱ-2012-2）,广西壮族自治区科学技术协会。 （2）2012年度广西自然科学优秀论文二等奖：来自于海洋宏基因组文库的新型延胡索酸水合酶基因的克隆和生化性质鉴定 （Ⅱ-2011-038）,广西壮族自治区科学技术协会。 ⑦成果简介 酶制剂在应用过程中常出现稳定性脆弱或酶活易丧失等异常情况,如何寻找可以抵抗各种严酷条件的新酶蛋白,成为科学家们迫切需要解决的关键科学问题。该项目利用微生物宏基因组学技术,通过开展有关亚热带区域特生态环境系统中微生物基因资源的研究,系统完成了多个重要新酶基因的鉴定。诸如率先系统完整的鉴定了编码延胡索酸水合酶的新基因fumF;系统的完成了系列编码β-葡萄糖苷酶新基因的鉴定;率先系统的鉴定了编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的新基因 spi1C;率先系统的鉴定了编码氨基酸氧化酶的新基因daoE;率先系统的鉴定了编码新的氨基酸脱羧酶的功能基因undec1A等。这些成果为下一步的应用推广提供了理论支持。