[00150291]A Large-Scale Mutational Analysis of Two-Component Signaling Systems of Lonsdalea quercina Revealed that KdpD-KdpE Regulates Bacterial Virul

由LonsdaleaLonsdaleaLonsdaleaLonsdalea quercinaquercinaquercinaquercina subsp. populi引起的欧美杨细菌性溃疡病在国内主要种植区河南、山东大面积发生,该病害在天津也有分布,是国内近年来发现的一种新的杨树细菌性病害。本研究通过生物信息学分析鉴定和序列比对L. quercina subsp. populi N-5-1基因组中的双组分信号转导系统,研究结果如下： （1）利用已测定的病原细菌菌株N-5-1的基因组序列,通过生物信息学分析,以及识别与HK和RR磷酸化过程相关的保守结构域,鉴定出18个组氨酸蛋白激酶和24个反应调节蛋白。 （2）利用目的基因片段与自杀载体连接方法成功构建42个重组载体,并根据插入失活突变体构建的方法成功得到了32个插入失活突变体,获得了19个突变后导致病原菌毒力性显著下降的双组分信号转导系统蛋白编码基因。 （3）kdpE的插入失活严重影响了病原菌的生长速度、游动性和毒性,是一个与病原菌致病性密切相关的双组份信号转导系统蛋白编码基因;缺失kdpE和过表达kdpD使病原菌的毒力明显下降的毒力明显下降;同时kdpD和kdpE位于同一操纵子内,KdpD能够与KdpE特异性地结合（Kd = 5.73 ± 0.64 μM）,二者可能组成一个双组分信号转导系统;KdpD作为组氨酸蛋白激酶具有自激酶活性,但未检测到其对下游调节蛋白KdpE的磷酸转移酶活性。 （4）为了揭示调节蛋白KdpE对下游信号分子的调控机制,采用ChIP-seq技术获得了14大类共计44个受调控基因,主要参与致病性、适生性、物质转运、细胞结构、物质能量代谢等途径;采用EMSA技术证实KdpE通过一个不完美的回文序列直接结合到这44个基因的启动子区,从中选取3个与病原菌毒力或逆境胁迫应答有关的基因;RT-PCR检测发现KdpE正调控这3个基因的转录水平,揭示了KdpE以转录因子形式对这些基因的转录水平进行调节从而应答环境信号刺激的调控机制;过表达这3个下游基因可以恢复KdpE缺失突变体对氯霉素胁迫的耐受性,从生物学功能上证明了其信号通路的上下游关系。