本发明提供了一种定量测定血清中甘胆酸的检测方法,包括将血清待测样、甘胆酸荧光标记物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育,得到检测样;对所述检测样进行荧光偏振光检测,获得偏振光强度;根据所述偏振光强度与预设的甘胆酸标准曲线,得到血清待测样中甘胆酸的浓度。本发明提供的检测方法能够简便快捷、准确的测定血清中甘胆酸的浓度;而且,采用本发明检测方法进行实时检测时,在线检测干扰因素少、线性范围宽、灵敏度高。实验结果表明,本发明提供的检测方法的线性范围为884.49~7655.74ng/mL,决定系数R2=0.9992,IC50=2602.20ng/mL,最低检测限为480.28ng/mL,其线性范围宽,检出限低,灵敏度高。