本发明提供了一种测试尿液中甘胆酸含量的检测方法,包括a)将尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育,得到检测样;其中,甘胆酸示踪物具有式(Ⅰ)所示结构;甘胆酸多克隆抗体是由甘胆酸与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清;b)对所述检测样进行荧光偏振光检测,获得偏振光强度;c)根据所述偏振光强度与预定的甘胆酸标准曲线,得到尿液待测样中甘胆酸的浓度。本发明提供的检测方法能够简便快捷、准确的测定尿液中甘胆酸含量;而且,采用本发明检测方法进行实时检测时,线性范围宽、准确且灵敏度高,是一种易于高通量检测且低成本的检测方法。