本发明涉及一种高精度荧光各向异性显微成像装置及方法。在反射式荧光显微镜上,光源发出的光通过起偏器、激发滤波片和分光镜后,被显微物镜聚焦于样品上;样品反射的荧光通过物镜、分光镜和发射滤波片后,又通过一个可调角度检偏器,在CCD相机的像平面上成像;计算机控制可调角度检偏器绕成像光路的光轴步进回转,每旋转一个角度,CCD拍摄一帧偏振荧光图像,共计拍摄M幅图像;最后利用傅里叶变换,从M幅图像中计算出荧光各向异性的图像。本发明的特点是建立一种单通道荧光检偏光路,使荧光各向异性的测量分辨率大幅度提高,并且该显微成像系统具有更高的稳定性和更好的抗干扰能力。