本发明涉及一种双通道、单光路结构的荧光各向异性显微成像装置及方法,适合于透射式和反射式显微镜。本发明装置中,扭曲向列型液晶偏振旋转器和检偏器置于荧光成像光路,扭曲向列型液晶偏振旋转器的回转中心与荧光成像光路的光轴中心重合;起偏器的起偏方向、检偏器的检偏方向和扭曲向列型液晶偏振旋转器入射光一侧的液晶分子排列方向三者平行。本发明方法是通过切换高低电平信号,分时控制扭曲向列型液晶偏振旋转器输出光的偏振状态,数码相机相应拍摄两个互相垂直偏振方向的被测样品荧光图像,最后计算出被测样品的荧光各向异性显微图像。本发明能够在提高荧光各向异性成像精度的前提下,充分利用数码相机的视场,简化系统结构,成本更低。