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本发明公开了一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法,提供5个基因的49个用于评估人类罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因变异位点,利用MassARRAY核酸质谱技术对这些位点进行基因分析检测。本试剂盒单碱基延伸时只加入用于延伸突变型基因的ddNTPs,并且ddNTPs带有生物素标记,使用带有链霉亲和素标记的磁珠对延伸产物进行捕获,去除杂峰的信号干扰,大大增加延伸产物中突变型基因的信号值,提高试剂盒的灵敏度。应用本方法检测循环肿瘤DNA样本,20ng上样量其灵敏度可低至0.1%。此方法相较qPCR及二代测序平台,具有设计灵活、准确性高、成本低、操作简便等优势。