本发明公开了一种高纯度天然胶原纤维及其制备方法,其特点是以新鲜可溯源的动物肌腱或跟腱为原料,通过预处理、浸水、超临界二氧化碳流体脱脂、浸碱、第一次酶处理、浸酸、第二次酶处理、盐析、离心纯化等工艺,得到高纯度天然胶原纤维。通过该方法得到的高纯度天然胶原纤维,是天然胶原分子的聚集体,除拥有胶原的四级结构和保留有胶原本身的生物活性外,还具有更多的天然组织中胶原空间结构特征,可更大程度地仿生天然组织结构,与胶原材料相比,本发明所制备的天然胶原纤维具有更为优异的力学性能、热稳定性和生物降解性能,结构更为稳定且易于保存,又能激活细胞的特性基团表达、维持细胞正常的特性表达,有利于细胞的黏附、生长与增殖,可用于制备止血材料、组织工程支架材料、医用整形美容材料等。