本发明提供了一种具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球及其制备方法与应用,具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球由内到外依次包括:聚合物包裹超顺磁性纳米颗粒构成复合纳米球的内核和含有蛋白质分子印记的聚合物外壳。利用一种改进的微乳液聚液方法,使超顺磁性纳米颗粒紧密排列在聚合物纳米球中,保留了高的饱和磁化强度。通过所述复合纳米球的内核的外围的羟基化改性层与聚合物外壳、印记的蛋白分子间形成丰富的氢键,利用两次冰浴超声处理,促进了印记的蛋白质分子在聚合物外壳中均匀、牢固的分布,有效地降低非特异性结合位点,提高了超顺磁性复合纳米球与目标蛋白质分子的选择性结合能力,实现高选择性的分离目的。