本发明公开了一种基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法,该构建方法包括获得融合子,得到DNA片段PTEF1-ERG25-URA3,将DNA片段PTEF1-ERG25-URA3导入到菌株1的TRP1基因的上游片段内部,在MM(-Umix)平板上筛选得到菌株2;得到敲除了URA3标记的菌株3;再获得色氨酸缺陷型菌株4;最后质粒酶切后导入菌株5,再平板筛选转化子获得菌株6,再将菌株7进行驯化筛单菌后得到菌株SEB5。该方法获得的木糖发酵酵母菌株能够有效利用木质纤维素类生物质中的木糖进行乙醇的生产,提高木质纤维素生物质的利用率,并且能够进一步提高乙醇的产率。