本发明提供了一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价的方法。该方法以动物皮为原料,制备富含油脂的皮粉底物;在水介质中,脂肪酶与皮粉吸附的油脂接触,催化皮粉内的油脂水解生成脂肪酸,在一定条件下反应后,同时用盐和酸终止酶反应,并使浴液中的脂肪酸盐转变成脂肪酸,使油脂和脂肪酸完全被皮粉吸附。用溶剂完全抽提皮粉中生成的脂肪酸,通过测定单位时间脂肪酸的产生量来对脂肪酶活力及性能进行表征。该方法可以在较宽pH范围测定脂肪酶的活力及对脂肪酶性能进行评价,所用底物和反应条件与动物皮处理过程中脂肪酶对皮内油脂作用的条件相近,测定结果对以动物皮为原料的制革、制裘、制胶和胶原提取等脂肪酶应用领域中的脂肪酶的选择和应用条件的优化更具有指导意义。