本发明公开了一种嗜水气单胞菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法,该方法包括如下步骤:(1)收集嗜水气单胞菌活菌体0.5~0.7g,用5~7mL去离子水重悬,反复冻融破碎细胞,离心后收集上清液,得到模板;(2)将该模板与氟喹诺酮类药物耐药基因检测引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParC-F和ParC-R共同混合后,进行PCR扩增;(3)步骤(2)的PCR扩增结束后,进行琼脂糖凝胶电泳并送交测序。本发明的检测方法敏感、特异、快速,可以检测极微量的目的基因进行检测,而不需要经过费时的嗜水气单胞菌培养阶段。