本发明属于生物工程技术领域,提供了一种两步盐析萃取分离发酵液中1,3‑丙二醇、乙酸和丁酸的方法。该方法为:将可溶性酸性无机盐溶解于1,3‑丙二醇发酵液中,加入疏水性有机溶剂,振荡混合,室温下静置分相,进行第一步盐析萃取,上相为富含丁酸的有机相,下相为富含1,3‑丙二醇和乙酸的盐相;用碱溶液或碱性无机盐溶液反萃取上相中的丁酸;向下相加入亲水性有机溶剂,进行第二步盐析萃取,萃取1,3‑丙二醇和乙酸。本发明解决了目前发酵法生产1,3‑丙二醇分离工艺中存在的1,3‑丙二醇与副产物难以分离、成本高等问题。该方法工艺简单,分离时间短,回收率高,分离成本低,是一种很有工业应用前景的分离方法。