本发明公开了一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法和应用,属于色谱科学、细胞生物学及受体药理学领域。该方法将两种不同受体类型的细胞分别制备成细胞膜色谱固定相,再将两种细胞膜色谱固定相混合均匀,得到两种受体类型的混合固定相,最后将混合固定相湿法装柱,构成双靶标细胞膜色谱柱。本发明制备的双靶标细胞膜色谱柱在保持原有细胞膜色谱柱活性识别和色谱分离特性的基础上,增加了活性识别的位点,能够识别复杂体系中“单组分单靶标”、“单组分双靶标”及“多组分双靶标”的目标组分,为多元药物的开发提供新的技术手段,并显著提高复杂体系中目标组分的筛选效率。