本发明为一种改良的定量检测海水青鳉鱼卵黄原蛋白的试剂盒、制备方法及应用,属于环境监测领域。试剂盒中包括1块空白96孔酶标板、1支海水青鳉鱼卵黄脂磷蛋白标准品、1支兔抗海水青鳉鱼卵黄原蛋白抗体、1支辣根过氧化物酶标记的兔抗海水青鳉鱼卵黄原蛋白抗体、包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液及终止液各1支。通过“凝胶过滤层析+离子交换层析”两步法分离纯化了海水青鳉鱼卵黄脂磷蛋白,获得的卵黄脂磷蛋白与卵黄原蛋白具有相同的免疫原性,作为检测卵黄原蛋白的标准品,且热稳定性更佳。本试剂盒可以快速、灵敏的定量检测海水青鳉鱼样本中的卵黄原蛋白,能够为海洋环境雌激素污染的生物监测提供技术手段。