本发明公开了一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法,先将猪肺抑肽酶溶于pH7~9的缓冲液中得到蛋白酶缓冲液,再将其加入到经过活化的磁性壳聚糖微球中,水浴振荡偶联4~8h后得到偶联猪肺抑肽酶的磁性壳聚糖微球;再将其加入蚯蚓纤溶酶粗酶溶液在30-60℃恒温水浴摇床中振荡固化反应0.5-3h;反应结束后,反复洗涤至洗涤液中检测不出蛋白为止,磁铁分离收集即可得到固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球,其酶活性为15-30U/mg。本发明以猪肺抑肽酶为配基,与磁性微球偶联,运用用于蚯蚓纤溶酶的分离纯化,提高了蚯蚓纤溶酶的分离纯化选择性,而且磁性微球易于与蚯蚓纤溶酶分离。