本发明公开了多种生物活性剂应用于焦化柴油脱硫的方法,包括以下步骤:(1)把胆碱肌醇复合粉或胆碱肌醇复合片添加到焦化柴油中,用磁力搅拌器中加热和搅拌,反应60-100min,取出冷却至室温;(2)把胰岛素添加到焦化柴油中,然后置于恒温水浴环境中恒温加热搅拌;(3)把胆酸类活性剂添加到焦化柴油中,然后置于恒温水浴环境中恒温加热搅拌1-24小时;(4)把催化剂和氧化剂先后添加到焦化柴油中,催化氧化反应50-100min;(5)按体积比1∶1加入萃取剂,用磁力搅拌器搅拌5-10min,再倒入分液漏斗,静置20min,收集柴油层。本发明的方法脱硫精制反应条件温和,绿色环保,脱硫率高,焦化柴油收率显著且色浅味轻。