本发明一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、其构建方法及其应用,属于基因工程、病毒学领域。本发明构建了多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体,并利用慢病毒介导方法将该载体转入BHK-21细胞中获得对口蹄疫病毒复制有抑制作用的转基因细胞,后将该慢病毒载体注入动物皮下,获得抗口蹄疫嵌合体动物。此外,利用多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体制备出抗口蹄疫转基因小鼠,对O型口蹄疫病毒具有一定抗性,在5LD50病毒滴度下乳鼠的存活率获得明显提高。因此,应用本发明可望通过抗口蹄疫转基因家畜的制备,对现有普通品种进行改良从而提高易感物种对口蹄疫病毒的抵抗力,在一定程度上减少口蹄疫带来的经济损失。