一种测定三聚氰胺含量的非标记电化学免疫传感器及其制备方法和应用。所述的免疫传感器,包括基底电极,基底电极表面修饰石墨烯-三聚氰胺-壳聚糖复合物,并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。其制备方法是以石墨烯/壳聚糖复合材料固定三聚氰胺抗原于玻碳电极表面。所述的免疫传感器基于免疫反应的竞争模式,利用K3Fe(CN)6为探针,以循环伏安法和差分脉冲伏安法监测免疫反应,可用于三聚氰胺含量的检测。本发明的传感器具有较高的灵敏度和专一性,检测方法简单,适用范围广泛,检测限可达0.2ng/ml,线性范围5~1500ng/ml,具有快速高效、灵敏度高和特异性好、操作简单、成本低等特点。