[00113493]精氨酸工程菌的构建及试验室生产工艺研究

L-精氨酸是一种重要的蛋白氨基酸，它广泛用于医药、食品及香料的生产中。L-精氨酸是含有二氨基一羧基的四碳氨基酸，属于碱性氨基酸。如何获得精氨酸高产菌株以便工业化大规模生产L-精氨酸，一直是国内研究的难点，到目前为止国内还没有此方面的高产菌株，国内所需的精氨酸基本上依赖进口，因此选育高产精氨酸生产菌株成为一个迫切需要解决的问题。乙酰谷氨酸合成酶（argA）是精氨酸合成途径中的第一个关键酶，也是唯一受精氨酸反馈抑制的酶，为了解除精氨酸对其的抑制，我们从大肠杆菌K12菌株中提取总DNA，经酶切和设计的适当的引物，克隆到argA基因到pUC18质粒上，argA基因表达产物乙酰谷氨酸合成酶的标准酶代码为EC 2.3.1.1，所获得的DNA片段的长度为1575bp；另外，为了促进所构建的大肠杆菌具有庶糖利用能力，我们从原苏联引进了蔗糖水解酶的基因sacC，用于提高工程菌利用糖的速率和能力，其大小为2.5KB。该技术正是通过基因技术，依据精氨酸的生物合成、降解途径构建了产L-精氨酸的工程菌菌种；通过对工程菌的筛选和对发酵、后提取工艺研究，发酵周期为72小时，精氨酸的生产能力在30克/升以上，杂酸量少于20%，糖转化率达到40%以上，提取率在60%左右。该工程菌菌种的产精氨酸能力优于世界上其他同类菌种。其特点为：1. 在国内率先采用基因工程技术构建成了精氨酸产生菌。2. 同时，工程菌受体菌LGE-28带有蛋氨酸和苏氨酸的营养缺陷型，增强了精氨酸合成途径中前体物天门冬氨酸的合成，进一步提高了精氨酸的生产量。3. 提出了完整的可用于中试的实验室发酵生产精氨酸及后提取的工艺技术。用该技术得到的L-精氨酸的质量符合药典的标准。取得成果：1. 工程菌构建：通过基因技术，依据精氨酸的生物合成、降解途径构建了产L-精氨酸的工程菌。重组质粒上带有谷氨酸合成酶（argA）基因和蔗糖酶基因（sccC）；受体菌上带有蛋氨酸（Met）和苏氨酸（Thr）的缺陷型标记。2. 发酵技术研究：对工程菌的发酵培养基进行了筛选，并对发酵工艺参数进行了确定。使精氨酸的发酵周期为72小时，精氨酸的生产能力在30克/升以上，杂酸量少于20%，糖转化率达到40%以上。3. 后处理工艺研究：提取率在60%左右。其特点为：1. 在国内率先采用基因工程技术构建成了精氨酸产生菌。2. 工程菌受体菌LGE-28带有蛋氨酸和苏氨酸的营养缺陷型，增强了精氨酸合成途径中前体物天门冬氨酸的合成，进一步提高了精氨酸的生产量。3. 提出了完整的可用于中试的实验室发酵生产精氨酸发酵工艺工艺。4. 研究出了创新性的后提取的工艺技术，精氨酸与其它的杂酸比较彻底，一次既可提出符合药典标准的产品，不需进一步的重结晶去除杂酸，提取率大于60%。目前我国临床氨基酸输液的1亿瓶左右，L-精氨酸用于临床输液量每年100～150吨，预计2005年达200～250吨，用于食品、保健品、化妆品等行业难以统计。国内由于菌种的产酸率较低而不能实现工业化生产，基本上依赖进口；国际上东欧及西南亚各国都不生产，市场较大。在自治区政府及有关部门的支持下，我所现已建成含符合GMP标准的中试车间，可进行该项目的中试研究，完成工业化生产中试工艺研究，中试产量预计可达到5吨。按照成本测算，每吨成本10万元左右，国内市场价每吨20～30万元，可见其应用前景和效益是十分可观的。