[00121183]嗜热酸性普鲁兰酶产业化关键技术的研究

(一)将嗜热细菌T.lettingae TMO的普鲁兰酶（Tlet1262）基因进行PCR扩增,与pET15b载体连接,转入大肠杆菌DH5a中,经NdeI和SalI双酶切鉴定,成功构建重组质粒pET15b-Tlet1262。将重组质粒pET15b-Tlet1262转入大肠杆菌BL21-CodonPlus （DE3）-RIL中,0.2 mM IPTG诱导表达,经超声波破壁,75℃热处理,Ni-NTA柱亲和层析纯化后,得到纯化的普鲁兰酶蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,分子量是97.0 KDa。 （二）酶学性质研究表明,该酶的最适温度与最适pH分别为90℃与pH5.4。该酶具有明显的热稳定性,其在100℃时的半衰期为150 min;在最适反应温度90℃处理150 min,酶活力稳定在80%以上。该酶具有极高的热稳定性和耐酸性,在高温70℃和酸性条件pH为5.0处理20小时,仍保持50%以上的活性,是目前所发现的耐酸性最强的嗜热普鲁兰酶。该酶对不同底物水解活性不同,普鲁兰糖＞支链淀粉＞可溶性淀粉＞直连淀粉。该酶水解普鲁兰糖的产物为麦芽寡糖和麦芽三糖,属于I型普鲁兰酶。该酶对金属离子（Mg2+, Mn2+, Co2+, Ni2+）、PMSF、变性剂Tween20和Trtion-X100具有很好的抗性。Ca2+具有明显的激活作用,表明Ca2+ 是该酶活性中心的辅助因子。该酶对低浓度有机溶剂（20%, W/V,乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、甲苯、氯仿） 有一定抗性,高浓度有机溶剂抑制酶活性明显。 （三）设计并构建了突变体M1、M2和M3,并在大肠杆菌中成功表达。比较了突变体M1、M2和M3及野生型酶酶活性的大小,发现突变体M1显著提高了酶活力,达到150 U/mL。在比较突变体酶和野生型酶的动力学常数的试验中,也发现突变体M1的米氏常数Km和表观数率常数kcat/Km显著提高,表明突变体M1突变的位点可能改变了酶的活性中心微环境,从而提高了酶的活性。 （四）构建高温酸性普鲁兰酶在毕赤酵母表达载体pPIC9K-Tlet1262,经过电转化毕赤酵母GS115,通过含GS418（6mg/ml）的YPD抗性平板筛选,得到了3个可能含有10-15拷贝数的转化子,在0.5％甲醇诱导7d,上清发酵液酶活力初步达到1.6 -1.8 U/mL。在发酵罐高密度细胞培养的试验中,细胞经甲醇诱导132小时后,其酶活达18 U/m1。测得诱导132小时,胞外分泌的蛋白量达到258mg/L,酶比活达到120U/mg。