[00125442]自然发酵乳中乳酸菌生物多样性及功能基因组研究

选取pepN、pepX 等蛋白水解关键基因和6-10个持家基因为等位基因,构建用于乳酸菌功能基因微进化分析的MLST技术,完成了298株Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、240株Lactobacillus casei、209株Lactobacillus fermentum、249 株Lactobacillus helveticus、179 株Lactobacillus plantarum、246株Streptococcus thermophilus、224 株Lactococcus lactis subsp lactis、186株Leuconostoc mesenteroides、50 株Leuconostoc lactis 和39株Enterococcus faecalis等10个常见种,1,920株乳酸菌的多位点序列分型研究,共鉴定出744个序列型,系统揭示了不同地域自然发酵乳制品中乳酸菌的遗传背景和群体结构,指出分离株的序列型与分离地呈明显规律性分布,表明自然生态环境在遗传异质性形成过程中扮演着非常重要的角色。乳酸菌分离株微进化分析同时指示出蛋白水解关键基因在不同进化分支的差异,为菌株定向筛选提供科学的指导。 基于上述 MLST 分析技术,结合Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ND02和Streptococcus thermophilus ND03全基因组信息,以glyA、pgm、aldh、pdc、nox、ackA 和adh 7 个产酸、产粘、产香等关键基因为靶点,建立了基于MLST 的优良菌株高通量筛选技术。从菌种资源库中的339 株嗜热链球菌和315株保加利亚乳杆菌中筛选出19 株用于发酵乳生产的菌株,加快了乳酸菌资源的开发利用进程。 采用二代高通量测序技术完成 Lactobacillus、Leuconostoc 和Pediococcus 等乳酸菌6 个属213个模式菌株基因组精细图谱的绘制,从全基因组水平追溯Lactobacillus不同菌种分化的历程,揭示了菌株进化分化伴随的功能基因进化历程。指出乳杆菌属实为并系类群,是从一个共同祖先进化分化而成,即兼性异型发酵乳杆菌为了适应环境,逐渐分化形成严格同型和异型发酵乳杆菌。 建立新种分类新的基因组系统发育框架,同时共鉴定出146个CRISPR位点,表明乳杆菌属种广泛存在CRISPR系统,其中68个Ⅰ型、76 个Ⅱ型以及2个Ⅲ型CRISPR-Cas 系统。通过对CRISPR 特征进行比较分析,发现了通用Cas1蛋白以及对应的CRIPR 重复序列的多样性,与分别代表Ⅰ型、Ⅱ型系统的两大分枝具有一致性。功能基因组分析显示,在不同种的分化过程中,伴随有蛋白水解、碳水化合物代谢基因获得和丢失的现象,也造就了丰富的碳水化合物水解酶系统、转运系统以及多样的蛋白水解酶。这些研究不仅为乳酸菌的开发利用提供真实的遗传背景和坚实的理论基础,同时为优良菌株生产特性相关功能基因的精细定位提供科学依据。 鉴于双歧杆菌在肠道菌群的重要性,完成了双歧杆菌属46株模式菌株的全基因组测序分析,深入了解双歧杆菌属的遗传多样性和进化史,揭示出该属祖先种为蜜蜂分离株,然后逐渐分化到非灵长类动物和家禽,再到猴子和人类的进化路线,并伴随与分离环境相关的功能基因获得和丢弃,为有益乳酸菌的定向筛选提供新的研究思路。