[00132069]乳酸菌谷氨酸脱羧酶的构效关系研究及分子改造

谷氨酸脱羧酶（GAD）是乳酸菌抗酸系统以及生物法制备抑制性神经递质γ-氨基丁酸的关键酶。研究通过优化蛋白质纯化和结晶条件,获得了高质量的谷氨酸脱羧酶（GAD）蛋白质晶体,利用X-ray衍射技术获取了GAD晶体的衍射数据,并通过分子置换法解析了GAD的晶体结构,在世界上首次获得了乳酸菌GAD的晶体三维结构（PDB ID：5GP4）。建立了一个基于比色法的GAD活性高通量筛选方法,在GAD酶活性的快速检测以及活性的高通量筛选中具有良好的适用性。基于晶体结构信息,识别出了对 GAD 的结构维持及催化特性有重要的影响氨基酸残基位点Q51、D88、S307、K413以及 N-末端区域,并通过定向进化和半理性设计等方法,获得了多个具有特殊性质的突变酶：突变酶K413A在50 ℃的半衰期是野生酶的2.1倍;突变酶K413I酶活力约为野生型的1.6倍;C末端缺失14个氨基酸的GAD突变酶△C-termini突变酶解除了C末端氨基酸序列对活性口袋的“封闭”效应,在pH 6.0反应2 h时GABA的产量是亲本酶的4.8倍。通过对这些突变酶的构效关系研究,解析了影响GAD催化活性和热稳定性的关键结构信息,阐明了GAD的C末端影响酶最适pH的分子机理。研究不仅填补了乳酸菌GAD晶体结构的空白,为GAD的应用和改造提供了重要的晶体结构信息,而且通过分子改造有效改变了GAD的催化性质,深化了对GAD的结构、性质和功能的认识,为其他蛋白质的分子改造及构效关系研究提供了指导。研究共发表SCI论文10篇、EI论文6篇、一级期刊论文1篇,获得授权国家发明专利8项,相关研究成果被《Biotechnology and Bioengineering》、《Bioresource Technology》等国际著名学术期刊引用。