本发明是一种牛分枝杆菌LIP突变体蛋白及其制备方法和应用,牛分枝杆菌LIP突变体蛋白中心区的2个半胱氨酸(Cys)分别突变成甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)。制备牛分枝杆菌LIP突变体蛋白的方法,工艺过程包括:1)构建含pET 30a/LIP的基因工程菌;2)利用改进的培养基扩大培养后,用IPTG诱导表达;3)裂解菌体,溶解包涵体,纯化LIP突变体蛋白。本发明应用基因工程技术,首次在体外表达并获得了具有活性的牛分枝杆菌LIP突变体蛋白,并且建立了纯化、复性的方法;利用本发明的方法,LIP蛋白的表达量可达20mg/L培养基。