本[发明专利]提供了一种新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法,包括步骤:1)以Trizol试剂提取新型鸭呼肠孤病毒尿囊液的总RNA;2)采用PrimeScriptTM One Step RT‑PCR Kit试剂盒对步骤1)提取的总RNA进行克隆,其中使用的特异性引物包括L1引物对、L2引物对和L3引物对中的任意一对,所述L1引物对包括L1‑F引物和L1‑R引物,所述L2引物对包括L2‑F引物和L2‑R引物,所述L3引物对包括L3‑F引物和L3‑R引物。本[发明专利]的有益效果是:建立一步法扩增NDRV的L组全长基因序列的RT‑PCR体系,避免了常规PCR扩增后还需对基因片段克隆、连接、多次测序等增加繁杂工作。全长的扩增,亦为NDRV L组编码的蛋白研究奠定基础。